《實(shí)驗(yàn)用斑馬魚飼育技術(shù)條件》通過江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)審核
發(fā)布時間:
2020-12-14
ICS 07.080
CCS A40/49
32
江蘇省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)
DB 32 XXXXX
—
2020
實(shí)驗(yàn)用 斑馬魚 飼育技術(shù)條件
Technical requirements for breeding laboratory zebrafish
2020
-
XX
-
XX 發(fā)布 2020
-
XX
-
XX 實(shí)施
江蘇省市場監(jiān)督管理局 發(fā) 布Q/LB.
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-
XXXX
I
目 次
前言
................................................................................ III
1 范圍
............................................................................... 1
2 規(guī)范性引用文件
..................................................................... 1
3 術(shù)語和定義
......................................................................... 1
4 飼育魚房工藝布局
................................................................... 1
4.1 飼育魚房總體要求
............................................................... 1
4.2 飼育魚房功能分區(qū)
............................................................... 2
5 飼育設(shè)施
........................................................................... 2
5.1 流水飼育系統(tǒng)
................................................................... 2
5.2 靜水飼育系統(tǒng)
................................................................... 3
6 飼育環(huán)境條件
....................................................................... 3
6.1 溫度
........................................................................... 3
6.2 濕度
........................................................................... 3
6.3 空氣
........................................................................... 3
6.4 環(huán)境噪音
....................................................................... 3
6.5 光照
........................................................................... 3
6.6 飼育用水
....................................................................... 4
6.7 流水循環(huán)速度
................................................................... 4
6.8 日換水量
....................................................................... 4
7 飼育密度與餌料及飼喂
............................................................... 4
7.1 飼育密度
....................................................................... 5
7.2 飼育餌料
....................................................................... 5
7.3 飼喂
........................................................................... 5
8 繁育和遺傳資源保存
................................................................. 5
8.1 繁育安排
....................................................................... 5
8.2 新創(chuàng)制遺傳資源保存
............................................................. 5
9 倫理維護(hù)
........................................................................... 6
9.1 福利保障
....................................................................... 6
9.2 飼育人員技能
................................................................... 6
9.3 生長記錄
....................................................................... 6
9.4 標(biāo)識
........................................................................... 6
9.5 安樂死
......................................................................... 6
10 質(zhì)量規(guī)范
.......................................................................... 6
10.1 實(shí)驗(yàn)用斑馬魚來源
.............................................................. 6
10.2 胚胎的質(zhì)量
.................................................................... 6
10.3 仔魚的質(zhì)量
.................................................................... 6
10.4 幼魚與成魚的質(zhì)量
.............................................................. 6DB 32 XXXXX
—
2020
附錄 A（資料性） 草履蟲培育
...........................................................8
附錄 B（資料性） 豐年蟲幼蟲孵化及脫鹽處理..............................................9
參考文獻(xiàn)
..............................................................................10
IIQ/LB.
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-
XXXX
III
前 言
本文件按照GB/T 1.1
—
2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定
起草。
請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。
本文件由江蘇省實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)技術(shù)委員會提出并歸口。
本文件起草單位：南京堯順禹生物科技有限公司。
本文件主要起草人：趙慶順、池軍、王明開、張瓊。Q/LB.
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-
XXXX
1
實(shí)驗(yàn)用 斑馬魚 飼育技術(shù)條件
1 范圍
本文件規(guī)定了《實(shí)驗(yàn)用 斑馬魚 飼育技術(shù)條件》的飼育魚房工藝布局、飼育設(shè)施、飼育環(huán)境條件、
飼育密度與餌料及飼喂、繁育和遺傳資源保存、倫理維護(hù)以及質(zhì)量規(guī)范。
本文件適用于實(shí)驗(yàn)用斑馬魚的飼育。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，
僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本
文件。
GB 5749 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 18883 室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 31962 污水排入城鎮(zhèn)下水道水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)
3 術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本文件。
3.1
斑馬魚胚胎 zebrafish embryo
未出殼膜的斑馬魚胚胎，
一
般指0 dpf
~
3 dpf（days post fertilization；受精后天數(shù)）的斑馬魚
胚胎。
3.2
斑馬魚仔魚 zebrafish larva
出殼膜后至發(fā)育到未成為幼魚之前的斑馬魚，
一
般指4 dpf
~
28 dpf的斑馬魚。
3.3
斑馬魚幼魚 juvenile zebrafish
外部形態(tài)與成魚相似但未性成熟的斑馬魚，
一
般指 29 dpf
~
84 dpf的斑馬魚。
3.4
成年斑馬魚 adult zebrafish
性成熟、具備繁殖能力的斑馬魚。
一
般指年齡大于84 dpf的斑馬魚。
4 飼育魚房工藝布局
4.1 飼育魚房總體要求
獨(dú)立空間，凈高度不宜低于250 cm；地面防潮、防水、防滑、耐沖擊、平整；墻壁光滑、耐潮、不
吸水、抗擊碰性損壞、無縫隙。DB 32 XXXXX
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4.2 飼育魚房功能分區(qū)
包括去離子水制備區(qū)、循環(huán)系統(tǒng)流水處理區(qū)、飼育區(qū)、餌料生產(chǎn)區(qū)、儲存區(qū)、清潔區(qū)、隔離區(qū)和實(shí)
驗(yàn)區(qū)。
4.2.1 去離子水制備區(qū)
將符合GB 5749《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》要求的水進(jìn)行反滲處理制備成去離子水的區(qū)域，可位于飼
育魚房外獨(dú)立空間。
4.2.2 循環(huán)系統(tǒng)流水處理區(qū)
對飼育用水進(jìn)行過濾、紫外消毒、充氣、pH調(diào)節(jié)和電導(dǎo)率調(diào)節(jié)等集中區(qū)，可獨(dú)立于飼育魚房外。
4.2.3 飼育區(qū)
日常繁育斑馬魚的飼育區(qū)應(yīng)配備流水飼育設(shè)施飼育仔魚、幼魚與成年魚；配備靜水飼育設(shè)施飼育胚
胎、仔魚以及用于親魚繁育。
4.2.4 餌料生產(chǎn)區(qū)
包括培育開口餌料草履蟲的草履蟲生產(chǎn)區(qū)和孵化豐年蟲幼蟲的豐年蟲卵孵化區(qū)。分別配置供培育
草履蟲的容器和供孵化豐年蟲卵的專用孵化設(shè)備。
4.2.5 儲存區(qū)
配備冰箱存放斑馬魚餌料。
4.2.6 清潔區(qū)
設(shè)有清潔用水池以及魚撈等漁具存放區(qū)。
4.2.7 隔離區(qū)
外來的斑馬魚應(yīng)飼養(yǎng)在獨(dú)立于日常繁育飼育區(qū)之外的隔離區(qū)，胚胎經(jīng)消毒處理后方可進(jìn)入日常繁
育飼育區(qū)。
4.2.8 實(shí)驗(yàn)區(qū)
4.2.8.1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理的斑馬魚應(yīng)飼育在獨(dú)立于斑馬魚日常繁育飼育區(qū)外的實(shí)驗(yàn)區(qū)，可位于飼育魚
房外的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。
4.2.8.2 僅為完成遺傳改造而實(shí)施過顯微注射的斑馬魚胚胎或僅用于簡單顯微形態(tài)學(xué)觀測以評估
質(zhì)量的斑馬魚可回到日常繁育飼育區(qū)。
4.2.8.3 所有經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理的斑馬魚（包括胚胎、仔魚、幼魚和成魚）不應(yīng)回到日常繁育飼育區(qū)。完
成實(shí)驗(yàn)后通常需要進(jìn)行安樂死。
5 飼育設(shè)施
5.1 流水飼育系統(tǒng)
5.1.1 飼育架
2Q/LB.
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-
XXXX
應(yīng)由不銹鋼或其它防水防銹等無毒材料制成，層距不低于35 cm。
5.1.2 飼育缸
5.1.2.1 材質(zhì)要求無毒、無害、無放射性、耐腐蝕、耐高溫、耐高壓、耐沖擊、易清洗、易消毒滅
菌。
5.1.2.2 飼育缸由飼育蓋板、飼育缸體以及飼育后插板組成。
5.1.2.3 飼育蓋板設(shè)餌料投喂孔、流水單管孔和備用孔。
5.1.2.4 飼育缸體配有雙卡槽，可同時插入防仔魚和幼魚逃逸后插板以及導(dǎo)污后插板。
5.1.3 循環(huán)凈化設(shè)備
包括過濾處理單元、水體循環(huán)設(shè)備、消毒單元、充氣補(bǔ)氧單元、PLC自動化控制集成單元、給排水
分配單元、生物凈化水槽、系統(tǒng)流量監(jiān)控單元、pH控制單元和電導(dǎo)率控制單元。
5.2 靜水飼育系統(tǒng)
5.2.1 飼育架
同5.1.1。
5.2.2 交配缸
內(nèi)外膽結(jié)構(gòu)，材料要求與飼育缸（5.1.2）
一
致；內(nèi)膽底部高于外盒底部2 cm，并配有分離隔板和
蓋板。
5.2.3 飼育缸
同5.2.2，但無內(nèi)膽和分離隔板。
6 飼育環(huán)境條件
6.1 溫度
室溫23 ℃
~
30 ℃，24 h內(nèi)變動不超過?2.5 ℃。水溫25 ℃
~
29 ℃，24 h內(nèi)變動不超過?1.0 ℃。
6.2 濕度
相對濕度為45%
~
70%。
6.3 空氣
空氣質(zhì)量符合GB/T 18883《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。另需有新風(fēng)輸入，至少每4 h
~
5 h 輸入1次，每
次空氣交換量是整體空間的2倍體積。
6.4 環(huán)境噪音
低于70 dB。
6.5 光照
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采用14 h光照10 h黑暗的方式飼養(yǎng)。光照時間內(nèi)，飼育魚房內(nèi)和魚缸水面光照強(qiáng)度均為54 lx
~
324
lx。
6.6 飼育用水
6.6.1 電導(dǎo)率
450 μS/cm
~
550 μS/cm。
6.6.2 pH
pH 6.5
~
pH 8.0。
6.6.3 氨氮
含量＜0.02 mg/l。
6.6.4 鹽度
含量為0.3‰
~
0.5‰。
6.6.5 亞硝酸鹽
含量＜0.2 mg/l。
6.6.6 硝酸鹽
含量＜5 mg/l。
6.6.7 溶解氧
含量為5 mg/l
~
8 mg/l。
6.6.8 二氧化碳
含量為＜5 mg/l。
6.6.9 硬度
50 mg/l
~
100 mg/l。
6.7 流水循環(huán)速度
小于10 dpf的仔魚所在魚缸的水流速度應(yīng)小于10 ml/min，10 dpf至28 dpf仔魚所在魚缸的水流速
度為50 ml/min
~
80 ml/min，幼魚和成魚魚缸水流速度100 ml/min
~
150 ml/min。
6.8 日換水量
6.8.1 日排水量為系統(tǒng)總水量的 2%
~
10%，根據(jù)系統(tǒng)中所負(fù)荷魚量適當(dāng)增加。
6.8.2 日常繁育斑馬魚的飼育用水符合 GB/T 31962《污水排入城鎮(zhèn)下水道水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，可直接排
入城鎮(zhèn)下水道。
6.8.3 實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)用于斑馬魚實(shí)驗(yàn)處理的飼育用水應(yīng)按照生物類實(shí)驗(yàn)室的要求處理，不應(yīng)直接排入
城鎮(zhèn)下水道。
7 飼育密度與餌料及飼喂
4Q/LB.
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7.1 飼育密度
7.1.1 胚胎飼育密度
10 ml飼育用水飼育的胚胎數(shù)不超過50 枚。
7.1.2 仔魚飼育密度
4 dpf
~
17 dpf仔魚的飼育密度不超過40 尾/l、大于18 dpf的仔魚飼育密度不超過20 尾/l。
7.1.3 幼魚飼育密度
不超過6 尾/l。
7.1.4 成魚飼育密度
5 尾/l。
7.2 飼育餌料
7.2.1 斑馬魚餌料包括草履蟲活體和豐年蟲幼蟲活體，可自行培育或購買。
7.2.2 草履蟲培育方法見附錄 A。培育出的草履蟲活體直接用于斑馬魚仔魚的飼喂。
7.2.3 豐年蟲幼蟲孵化方法見附錄 B。孵化出的幼蟲經(jīng)脫鹽處理后用于斑馬魚的飼喂。
7.3 飼喂
7.3.1 飼喂總則
斑馬魚的每日飼喂次數(shù)為2次
~
4次。
7.3.2 飼喂量
7.3.2.1 發(fā)育時期為 4 dpf
~
6 dpf 仔魚，每次按草履蟲 1×10
5
個/l
~
3×10
5
個/l 投喂。發(fā)育時期
為 7 dpf
~
10 dpf 仔魚，以草履蟲和豐年蟲幼蟲混合喂飼，草履蟲每次投喂密度為 3×10
5
個/l
~
5×10
5
個/l，豐年蟲為 1×10
4
個/l
~
4×10
4
個/l，依發(fā)育時間逐步提高豐年蟲比例。發(fā)魚時期為
11 dpf
~
28 dpf 仔魚，以豐年蟲幼蟲飼喂，飼喂量為約 3×10
4
個/l
~
4×10
4
個/l。
7.3.2.2 幼魚每次投喂豐年蟲幼蟲 5×10
4
個/l
~
9×10
4
個/l。
7.3.2.3 成魚每次投喂豐年蟲幼蟲 1×10
5
個/l
~
3×10
5
個/l。
8 繁育和遺傳資源保存
8.1 繁育安排
使用交配缸進(jìn)行斑馬魚交配繁育。親本的雌雄比例為雌2尾?雄1尾
~
2尾，
一
個交配缸內(nèi)最多不超過7
尾魚。
8.2 新創(chuàng)制遺傳資源保存
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6
根據(jù)國家斑馬魚資源中心的要求填寫相關(guān)表格，向國家斑馬魚資源中心遞交新創(chuàng)制的基因組改造
的詳細(xì)遺傳信息；同時遞交新創(chuàng)制的基因型和遺傳背景明確的斑馬魚成魚，用于國家斑馬魚資源中心保
存。
9 倫理維護(hù)
9.1 福利保障
應(yīng)制定斑馬魚使用與管理的具體規(guī)章制度；不應(yīng)執(zhí)行任何不符合動物倫理學(xué)規(guī)范的斑馬魚使用與
管理方案。
9.2 飼育人員技能
斑馬魚生產(chǎn)與使用人員應(yīng)在上崗前接受專業(yè)培訓(xùn)，了解斑馬魚繁殖生物學(xué)的基本知識、飼育規(guī)范以
及使用與管理規(guī)范等。
9.3 生長記錄
記錄每日的水溫、室溫、濕度、飼喂、清潔、整理、魚缸清洗、受精卵收集、草履蟲飼育和豐年蟲
幼蟲孵化情況等。
9.4 標(biāo)識
黏貼在飼育缸或交配缸外的斑馬魚標(biāo)簽的信息應(yīng)包括：動物的受精日期、基因型和傳代代數(shù)等內(nèi)容。
9.5 安樂死
將斑馬魚置于冰水混合物中快速預(yù)冷2 min后，放入
-
20 ℃冰箱凍存。斑馬魚安樂死后應(yīng)及時轉(zhuǎn)移
至飼育魚房外的專用斑馬魚尸體存放冰箱的冷凍室中凍存，集中進(jìn)行無害化處理。
10 質(zhì)量規(guī)范
10.1 實(shí)驗(yàn)用斑馬魚來源
實(shí)驗(yàn)用斑馬魚的遺傳背景應(yīng)該明確。不應(yīng)飼育遺傳背景不明的斑馬魚；不應(yīng)使用來源于寵物市場的
斑馬魚。
10.2 胚胎的質(zhì)量
應(yīng)具備與發(fā)育時期
一
致的正常的顯微形態(tài)學(xué)特征。
10.3 仔魚的質(zhì)量
10.3.1 應(yīng)從殼膜中孵出，具正常的顯微形態(tài)學(xué)特征，可在水中自由游泳。
10.3.2 4 dpf 仔魚魚鰾的后部腔室開始充氣。約 20 dpf，仔魚魚鰾的前部腔室開始充氣。約
21 dpf 時，魚鰾前后兩個腔室的充氣完成。
10.4 幼魚與成魚的質(zhì)量Q/LB.
□XXXXX
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XXXX
10.4.1 健康的斑馬魚應(yīng)保持充分放松的姿態(tài)以與水面平行的方式在水中游泳。
10.4.2 斑馬魚的正常行為包括均勻的呼吸（通過活動鰓蓋）、以及保持對游泳和捕食運(yùn)動的興趣。
10.4.3 斑馬魚生病的特征包括體重與體長的比例下降、急促的呼吸、明顯的身體組織的損傷（潰
瘍、外傷）、以及體色、體型和運(yùn)動方式等的改變。當(dāng)斑馬魚急速翻身、向
一
側(cè)傾斜、或者與水面
垂直也可以作為生病的特征。
10.4.4 表現(xiàn)出異于正常斑馬魚行為的基因組改造斑馬魚突變體，不應(yīng)視作病魚。
10.4.5 生病的斑馬魚通常要進(jìn)行及時的安樂死。
10.4.6 如果病魚十分珍貴，可將病魚轉(zhuǎn)移至隔離區(qū)隔離治療。
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A
A
附 錄 A
（資料性）
草履蟲培育
在3 l缸中加入0.1 g 氯化鈉（分析純）和約5粒大麥粒，倒入1.5 l
~
2 l 煮沸去離子水后混勻，放
置室溫待用，待溶液降至室溫后加入0.1 g酵母粉搖勻備用，吸取母液10%作為種子液，加入混合好的新
鮮培養(yǎng)液中，室溫下培養(yǎng)1周，于體視顯微鏡下檢測培養(yǎng)效果，
一
般可達(dá)到2,000 個/ml的草履蟲，此時
可直接使用。3周
~
4周后需利用種子液，再行培養(yǎng)新鮮草履蟲。Q/LB.
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B
B
附 錄 B
（資料性）
豐年蟲幼蟲孵化及脫鹽處理
豐年蟲幼蟲是通過購買市售的豐年蟲休眠卵孵化而來。孵化使用符合GB 5749《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)
準(zhǔn)》要求的市政自來水配制的溶液完成。孵化溶液含鹽量（使用50目以下的細(xì)海鹽或孵化專用海鹽）為
1.5%
~
2.5%；pH 8.0
~
pH 8.2（使用NaHCO3調(diào)節(jié)pH）；蟲卵密度為3 g/l；孵化溫度為25 ℃
~
30 ℃；孵化
時間為24 h
~
30 h。
孵化時，位于溶液底部設(shè)有充氣裝置，保證豐年蟲休眠卵處于懸浮狀態(tài)。
孵化完成后，拔去充氣管，靜置沉降10 min
~
15 min，此時豐年蟲幼蟲會沉至孵化器下部，打開孵
化器下部閥門即可收集孵化出的豐年蟲幼蟲。但此時因?yàn)辂}度太高還不能直接投喂，需要通過同樣的靜
置沉降的方法再將收集到的豐年蟲幼蟲用去離子水或流水系統(tǒng)飼育用水洗滌4 次后，方可投喂斑馬魚。DB 32 XXXXX
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參考文 獻(xiàn)
[1] 廣東實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所、中國科學(xué)院水生生物研究所、中國水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所、上海實(shí)
驗(yàn)動物研究中心、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所聯(lián)合編制，2017。國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動物魚類環(huán)境
與質(zhì)量控制》（征求意見稿）（含實(shí)驗(yàn)用魚 第1部分：遺傳質(zhì)量控制；第二部分：病原學(xué)等級及監(jiān)測；
第3部分：飼料；第4部分：環(huán)境條件）。2017年7月4日公示。
[2] 北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2014。北京市地方標(biāo)準(zhǔn) DB11/T 1053.1
-
2013《實(shí)驗(yàn)用魚 第1部分：
微生物學(xué)等級及監(jiān)測》、DB11/T 1053.2
-
2013《實(shí)驗(yàn)用魚 第2部分：寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測微生物學(xué)等級
及監(jiān)測》、DB11/T 1053.3
-
2013《實(shí)驗(yàn)用魚 第3部分：遺傳質(zhì)量控制》、DB11/T 1053.4
-
2013《實(shí)驗(yàn)用
魚 第4部分：病理學(xué)診斷規(guī)范遺傳質(zhì)量控制》、DB11/T 1053.5
-
2013《實(shí)驗(yàn)用魚 第5部分：配合飼料技
術(shù)要求》、DB11/T 1053.6
-
2013《實(shí)驗(yàn)用魚 第6部分：環(huán)境條件》。北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局2013
-
12
-
20
發(fā)布，2014
-
04
-
01實(shí)施。
[3] 農(nóng)業(yè)部，2017。病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范。2017年7月3日發(fā)布。
[4] Jolaine, M.W.
, Ralph, M.B.
, Carty A.
J
.
, 2009. Evaluation of rapid cooling and
tricaine methanesulfonate (MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio)
.
Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48:785
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