基因編輯技術(shù)是對細胞中的DNA序列進行精準操作從而改變細胞命運和生物體特征的技術(shù)，該技術(shù)為提高人類對于遺傳學的理解以及遺傳疾病的治療提供了重要的工具。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在約七十年的時間里，對于細胞和組織中基因組序列以及基因表達模式的決定、分析和改變的生物技術(shù)日新月異。尤其是CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)明，為基因編輯技術(shù)的發(fā)展帶來了革命性的變化。目前，CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)被用于操縱培養(yǎng)細胞和原代細胞、編輯動物和植物的基因組，極大地加快了基礎研究的步伐，也使得農(nóng)業(yè)和合成生物技術(shù)取得突破性進展【1-4】。而現(xiàn)在，我們正在進入一個新的時代，在這個時代中，基因編輯技術(shù)將用來失活或者修正病人體內(nèi)的致病基因，為患有遺傳疾病的人們提供挽救生命的治療方案【5】。

 

近日，加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna在Nature雜志上發(fā)表綜述文章，對目前基因編輯技術(shù)在臨床治療方面面臨的機遇與挑戰(zhàn)進行了總結(jié)，Bioart將此綜述進行編譯，以饗讀者！

 

 

基因編輯技術(shù)的應用范圍

 

人類疾病的成因一般都比較復雜，但有一些遺傳疾病是來源于單基因位點的突變。比如說囊泡性纖維癥、亨廷頓舞蹈證、杜氏肌營養(yǎng)不良以及鐮刀型貧血癥等均是人類基因組中單個基因突變造成的疾病。目前已知的單基因疾病超過了5,000種，影響范圍波及全世界2.5億人口的健康。其中最普遍的兩種單基因遺傳疾病是：鐮刀型貧血癥以及杜氏肌營養(yǎng)不良。

 

鐮刀型貧血癥是紅細胞中存在單基因突變，編碼β-球蛋白的基因HBB中攜帶了兩個拷貝的基因缺陷，而β-球蛋白是形成攜氧血紅蛋白的中所必需的。該疾病最早是在1950年由Linus Pauling以及他的同事們發(fā)現(xiàn)并找到的突變位點，在β-球蛋白中有一個A-T的突變造成谷氨酸變成纈氨酸的替換【6】（圖1）。這看起來小小的改變，卻造成紅細胞變成了鐮刀形狀進而引發(fā)病患血管堵塞、身體疼痛以及危及生命的器官衰竭。目前，在臨床方面骨髓移植能夠治療該疾病，但是這要求供體與患者的免疫系統(tǒng)相匹配不能出現(xiàn)排斥反應，而這樣的供體對于患者來說往往是可遇而不可求的。理論上，鐮刀型貧血癥的患者可以通過移除體內(nèi)造血干細胞以及使用基因編輯技術(shù)來糾正β-球蛋白中的突變或者是激活γ-球蛋白的表達來代替缺陷型的β-球蛋白（圖1）。編輯后的細胞可以重新植入病人體內(nèi)，這些編輯過的造血干細胞可以產(chǎn)生健康的紅細胞。

 

圖1 鐮刀型貧血癥單基因突變以及基因編輯治療

 

與其他疾病不同的是，鐮刀型貧血癥的治療可以從患者中直接提取細胞進行編輯，這使得該疾病或者其他的血液疾病相對來說通過更容易進行基因編輯而且在基因治療之后更容易追蹤細胞的變化。但大多數(shù)的單基因遺傳突變引起的疾病需要對體內(nèi)原位細胞進行基因標記才能糾正與疾病相關(guān)的遺傳缺陷。杜氏肌營養(yǎng)不良就是其中的代表性疾病之一，因為隨著時間的進展骨骼肌會逐漸地削弱和破壞【7】。杜氏肌營養(yǎng)不良的比例大概是每五千個男嬰有一個患有該疾病，DMD編碼的肌營養(yǎng)不良蛋白主要是維持肌肉的完整性（圖2）。隨著時間的推移，把病人會逐漸喪失行走能力，最終死于呼吸衰竭和心力衰竭，壽命通常不會超過30年。相較于延緩疾病進展的治療手段來說，基因編輯技術(shù)提供了極大的可能性永久性地恢復病人體內(nèi)缺失的肌營養(yǎng)不良蛋白。雖然造成杜氏肌營養(yǎng)不良的基因突變的位點超過3000種，但是最常見的還是在DMD基因中。而且有研究表明，恢復約15%比例的正常肌營養(yǎng)不良蛋白就會在臨床中表現(xiàn)出病癥的好轉(zhuǎn)【8】。

 

圖2 杜氏肌營養(yǎng)不良的病因及基因編輯治療

 

但此并不是隨意而為的，對于單基因突變的疾病的治療要求基因編輯手段的精確性以及安全性要非常高。因此，對用于人體基因組編輯技術(shù)的選擇也是非常重要的。

 

基因編輯技術(shù)及策略

 

使用DNA切割酶包括鋅指核酸酶（ZFNs）以及為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）均具有潛在的臨床基因編輯的可能性（圖3）。這些技術(shù)被證明可以用于編碼HIV受體CCR5失活【9】、造血干細胞中HBB基因突變改造【10】以及兒童癌癥中免疫細胞的編輯【11】等等。而CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展更是為基因組編輯提供了一個更加簡單高效的方法（圖3）。盡管CRISPR-Cas9誘導的基因編輯幾乎在所有的細胞種類中都是有效的，但是如何控制基因編輯結(jié)果的準確性仍然是領(lǐng)域內(nèi)的一大挑戰(zhàn)?？紤]臨床使用的安全性和效率問題，基因編輯技術(shù)需要精確、高效并且易于釋放到目標組織或者細胞中。CRISPR-Cas9可以用于堿基編輯，基因修改以及轉(zhuǎn)錄方面的控制。盡管此基因編輯方式已經(jīng)在培養(yǎng)的細胞中有了廣泛的使用，但是這些還不足以支持該技術(shù)在臨床方面應用的特異性和可輸送性。CRISPR-Cas9在臨床階段的早期應用的實例包括治療先天性的失明【12】以及接近于臨床應用的肝臟基因編輯【13】，這些初步的實驗結(jié)果將為CRISPR-Cas9在臨床方面的應用提供第一手的人體實驗數(shù)據(jù)。

 

圖3 基因編輯技術(shù)

 

組織特異性運輸方式的發(fā)展

 

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)即使在體外有效，也需要適合的、精準的方式將其運送到體內(nèi)需要基因編輯的組織或者細胞之中。目前在體外、組織中以及體內(nèi)科學家們曾經(jīng)嘗試過運輸方式主要包括以下三種：納米粒子、病毒載體或者是蛋白-RNA復合物電穿孔技術(shù)，這三種方法各有千秋（圖4）。目前體外比較受歡迎的運輸方式是將Cas9組裝進蛋白-RNA（核糖核蛋白，RNP）復合物然后使用電穿孔進行運輸。而在體內(nèi)運輸釋放過程中，挑戰(zhàn)性相對來說更大，一般會采用病毒載體（尤其是腺病毒相關(guān)載體）或者是脂質(zhì)納米粒子攜帶Cas9 mRNA以及一個sgRNA進行運輸。盡管這是一個不斷增加研究和開發(fā)的領(lǐng)域，但目前仍然難以確保高效、有針對性地將藥物輸送到人體所需的細胞中，這大大限制了基因組編輯在人體中進行臨床實驗的機會。

 

病毒運載工具包括慢病毒、腺病毒以及腺病毒相關(guān)病毒，在運輸效率以及組織特異性方面具有一定的優(yōu)勢（圖4）。一般來說，腺病毒相關(guān)病毒在體內(nèi)的運輸方式更有利一些，因為腺病毒相關(guān)病毒具有固有的組織趨向性以及臨床可控的免疫原性。而且，在脊髓性肌萎縮和先天性失明的臨床治療方面FDA已經(jīng)批準腺病毒相關(guān)病毒作為基因編輯的臨床技術(shù)方案，目前臨床方面的實驗正在進行當中【14】。但是腺病毒相關(guān)病毒也存在一些缺點，首先腺病毒的基因組只能容納編碼4.7kb左右的遺傳物質(zhì)，與其他病毒載體相比容納量??；第二，長時間基因編輯元件的表達的會出現(xiàn)脫靶效應或者免疫反應；第三，臨床方面的使用方法還沒有很友好，而且造價也比較高。這些因素都是不可忽視的挑戰(zhàn)。

 

圖4 基因編輯技術(shù)以及輸送方式

 

納米粒子可以作為另外一種基因編輯元件運輸?shù)姆绞?。其中包括脂質(zhì)介導的納米粒子、陽離子介導的納米粒子。但是有機納米粒子的運輸方式具有一個顯而易見的缺點，脂質(zhì)納米粒子運輸具有細胞毒性，而且細胞特異性會存在一些誤差。另外一種是無機納米粒子，其中納米金粒子由于其內(nèi)在的親和性使得基因編輯分子能夠很好的耦合在納米金粒子的表面。目前關(guān)于此方面的研究仍然在加強其定向運輸?shù)讲煌M織和器官的能力。

 

第三種運輸策略則包括電穿孔法，這涉及到用高壓電流脈沖細胞，在細胞膜上產(chǎn)生瞬間的納米級孔隙，這個過程允許帶負電荷的DNA或mRNA分子或CRISPR-Cas RNPs進入細胞。雖然目前該方法主要使用在體外細胞的基因編輯元件運輸，但是目前已有證據(jù)發(fā)現(xiàn)電穿孔法可以成功將Cas9運送到動物合子之中【15】。但是電穿孔的實用性總體上來說并不好，因此在大多數(shù)體內(nèi)基因組編輯應用中可能會應用會比較有限。

 

其實基因編輯元件在體內(nèi)的運輸和釋放目前可能仍然是人類細胞基因編輯的最大瓶頸，這一問題推動了多學科交叉促進運輸載體的優(yōu)化。相信在不久的未來，在人體細胞中高效率、高組織/細胞特異性的功能性元件運輸方式將會被發(fā)明以及進一步的優(yōu)化以便臨床方面的使用。

 

基因組編輯的準確性與安全性

 

基因編輯在臨床應用最基礎的要求是確?；蚓庉嫷臏蚀_性與安全性?！芭R床無小事”，任何用于臨床使用的治療方案都需要慎重，對于每一個病人個體而言，基因編輯的副作用對病人造成的傷害只有0%和100%，因此實驗技術(shù)進入臨床使用需要慎之又慎?；蚓庉嫾夹g(shù)最令人擔心的問題就是脫靶效應。盡管這些錯誤出現(xiàn)的幾率很低很低，但是一旦進入臨床，低幾率也會出現(xiàn)致瘤的可能性。科學家們需要進行仔細的測試，以確保臨床環(huán)境中基因組編輯的準確性和精確性，并最終通過控制目標位點識別和DNA修復結(jié)果來減少或消除脫靶事件的發(fā)生。

 

造成脫靶效應風險的內(nèi)在因素是由于該技術(shù)是基于DNA切割誘導基因編輯的，因此，科學家們希望通過不引入DNA雙鏈切割的方式進行基因編輯。目前，科學家們通過失活形式的Cas9(dCas9) 與抑制因子或者激活因子融合進行CRISPR干擾或者是CRISPR激活的基因編輯【16】。

 

而基因編輯的另外一個臨床應用方面的障礙就是安全性，安全性問題是關(guān)于細菌來源的基因編輯蛋白的免疫原性、預先存在的針對CRISPR成分的抗體引起炎癥的可能性以及未知的基因組編輯結(jié)果的長期安全性和穩(wěn)定性的考量。已有的Cas9抗體和反應體細胞在接觸CRISPR系統(tǒng)的病人體內(nèi)可以檢測的到，盡管目前尚不清楚這些抗體產(chǎn)生的濃度是否足以出發(fā)對于基因編輯酶的免疫反應【17】。在實驗而非臨床使用中，科學家們發(fā)現(xiàn)可能存在的非預期的情況是會造成p53信號通路的失活，這會造成細胞快速增殖以及腫瘤發(fā)生。而這種情況目前已經(jīng)可以通過實驗方案優(yōu)化而避免【18】。陳虎/鄧宏魁/吳昊合作團隊在2019年曾經(jīng)報道HIV陽性白血病患者接受CRISPR-Cas9編輯后造血祖細胞移植后，雖然細胞數(shù)量不足以緩解HIV感染，但是在移植超過19個月后，基因編輯細胞移植在病人身體中的臨床表現(xiàn)沒有引發(fā)任何的不良結(jié)果（詳見BioArt報道：專家點評NEJM |世界首例！陳虎/鄧宏魁/吳昊合作團隊報道首例CRISPR編輯干細胞治療HIV和白血病患者）【19】。這證明，基因編輯在人體上的應用已沒有不可逾越的障礙，而最終發(fā)展出安全和有效的人類基因編輯的臨床應用方案將指日可待。

 

基因編輯療法與可遺傳性基因編輯

 

基因編輯的臨床潛在應用已經(jīng)在鐮刀型貧血癥、肌營養(yǎng)不良以及其他的單基因突變疾病中被視為可能的治療方式。目前CRISPR在臨床方面可以大展宏圖的方面是提高嵌合抗原受體T細胞治療的效果【20】。而且，目前使用基因編輯技術(shù)應對退行性疾病也大有可用。對于鐮刀型貧血癥，潛在的遺傳缺陷可以通過標準化的CRISPR基因編輯進行校正，這種模式可以用于許多患者的患病情況，一定程度上簡化了臨床實驗，將進一步降低治療費用同時也滿足患者的治療需求。

 

但是，目前開發(fā)的所有基因組療法都是通過體細胞修飾治療患者體內(nèi)的疾病。這些治療旨在作用于接受治療的患者本人，也是傳統(tǒng)的疾病緩解方法。然而，目前關(guān)于基因編輯在生殖系統(tǒng)的應用可能會引入遺傳變化并將此變化遺傳給后代，其安全性、可操作性以及相關(guān)的問題都不可小覷。

 

圖5 人類生殖細胞基因編輯

 

人類生殖細胞基因編輯技術(shù)是指在卵細胞、精子以及胚胎中引入的可遺傳性的突變的技術(shù)。生殖細胞系基因組編輯已經(jīng)廣泛應用于動物和植物，并已被用于人類胚胎的研究之中。但是，當時出現(xiàn)了一份在人類胚胎中進行基因編輯導致女嬰出生的報告，引起了軒然大波。正如國際組織所強調(diào)的那樣，基因編輯技術(shù)在人體中的應用必須受到嚴格的監(jiān)管。這項工作以及與之相關(guān)的關(guān)于人類生殖細胞系編輯的討論提出了一些重要的問題，這些問題影響了科學的未來方向，也影響了伴隨任何此類應用而來的社會和倫理問題。首先，在人類胚胎中使用CRISPR-Cas9的研究已經(jīng)挑戰(zhàn)了目前人們對于DNA修復機制和這些細胞中發(fā)生的發(fā)育路徑的理解。第二，在人類胚胎中進行基因編輯的應用需要專業(yè)的人員以及社會的響應，不能肆意而為。考慮到科學、倫理和政策問題，不適合進行生殖系基因組編輯，最終導致人類懷孕。但是，在體外編輯人類胚胎和胚子的生殖系基因組應該在嚴格監(jiān)督和捐贈者同意的情況下，適當開展，這一定程度上可以促進未來可能的臨床應用的研究，因此不應該完全禁止對該項研究的公共資助。而在人類生殖細胞系中進行基因編輯在未來臨床應用中不應該進行，除非完全滿足一下條件：1）令人信服的醫(yī)學原理的解釋；2）支持其臨床應用的證據(jù)；3）符合倫理問題的正當理由；4）透明的公共過程，而且需要征求病人的完全了解和同意。另外，CRISPR-Cas9在人類胚胎中應用的問題是，如何在確?？煽渴褂玫耐瑫r推動技術(shù)向前發(fā)展。

 

展  望

 

在未來的5-10年內(nèi)，基因編輯技術(shù)用于許多疾病的臨床治療已經(jīng)備受期待。對許多人來說，這是改變醫(yī)療方案的重大機遇，是需要科學家、醫(yī)生、生物倫理學家以及監(jiān)管機構(gòu)的精誠合作，以確保基因編輯在臨床應用中的安全性、有效性的重要時代。這對很多病人來說影響巨大，刻不容緩。

 

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-1978-5

 

制版人：珂

 

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