CRISPR-Cas9系統(tǒng)需要與靶標(biāo)相鄰的PAM序列以促進(jìn)Cas9酶識(shí)別和結(jié)合至該位點(diǎn)（CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對(duì)，另一部分是Cas9蛋白和一個(gè)短DNA序列，這個(gè)短的 DNA序列通常在靶DNA的3'末端發(fā)現(xiàn)，被稱為protospacer adjacent motif，PAM）。

目前， SpCas9（ 來自Streptococcus pyogenes）和SaCas9（來自Streptococcus aureus）所識(shí)別的PAM序列多含鳥嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已報(bào)導(dǎo)的堿基編輯系統(tǒng)無法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）區(qū)域進(jìn)行精準(zhǔn)堿基編輯操作。特別是最常用的SpCas9酶需要GG PAM序列進(jìn)行識(shí)別，以至于其作用限制僅為基因組的9.9％，靶向區(qū)域十分局限。

為了解決這個(gè)問題，研究小組開發(fā)了一種名為SPAMALOT（Search for PAMs by Alignment of Targets）的分析軟件（通過目標(biāo)隊(duì)列來搜索PAM），對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行生物信息學(xué)搜索，以尋找是否存在任何具有限制性較低的PAM的Cas9樣酶序列。然后，他們從生物信息學(xué)搜索中創(chuàng)建出最佳匹配的合成版本，并評(píng)估了它們?cè)贑RISPR系統(tǒng)中的效用。

他們發(fā)現(xiàn)了一種特別有效的酶ScCas9，與SpCas9有著驚人的相似之處，來自 Streptococcus canis bacteria。有別于雙G PAM識(shí)別，ScCas9僅需1 個(gè)G的PAM序列，這使其在基因組中的靶區(qū)域明顯大于SpCas9，可以靶向?qū)⒔?0%的基因組區(qū)域，研究成果發(fā)表在《Science Advances》雜志。

“這種酶看起來幾乎與最初發(fā)現(xiàn)的酶相同......但它能夠靶向常用酶不能的DNA序列，”共同主要作者麻省理工學(xué)院Pranam Chatterjee這么解釋。

ScCas9的發(fā)現(xiàn)為基因治療帶來新希望

過去CRISPR系統(tǒng)無法到達(dá)的特異性突變，采用ScCas9后或?qū)⒂瓉磙D(zhuǎn)機(jī)。例如，基因的典型長(zhǎng)度大約為1000個(gè)堿基，如果治病目標(biāo)是敲除單基因的多個(gè)不同位置，研究人員可能更傾向選擇簡(jiǎn)單地敲除整個(gè)基因。但是，像鐮狀細(xì)胞性貧血這種單一堿基突變引起的疾病，ScCas9酶可以更精確地加以校正。“堿基編輯可不是隨意在1000個(gè)堿基上打靶，然后亂敲一氣，”Jacobson說。“你需要去到非常精確的位置，把CRISPR機(jī)器放在它旁邊，然后給它一個(gè)堿基編輯器（另一個(gè)與CRISPR相連的蛋白質(zhì)），進(jìn)去修理或改變堿基。”

新工具在這種情況下特別有用。法國(guó)國(guó)家自然歷史博物館的CRISPR專家Jean-Paul Concordet（未參與本研究）評(píng)價(jià)：他們完美地利用了鏈球菌Cas9序列的自然進(jìn)化，開辟了新基因組編輯工具挖掘的有力途徑。

ScCas9與SpCas9共享89.2％的序列相似性，這表明將其整合到CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)的當(dāng)前模型中應(yīng)該不太困難。 “ScCas9的氨基酸序列與SpCas9的氨基酸序列密切相關(guān)，因此預(yù)期它也很容易以重組形式生產(chǎn)，并且有望應(yīng)用于SpCas9的所有應(yīng)用。”

“此外，ScCas9使用與SpCas9相同的引導(dǎo)RNA，因此來自不同公司的合成引導(dǎo)RNA可以通用。”

該研究的下一步是繼續(xù)尋找更多的酶，這些酶可以增加CRISPR系統(tǒng)的靶標(biāo)范圍，同時(shí)保持其準(zhǔn)確性。與此同時(shí)，Chatterjee熱情推薦其他人能夠在自己的研究中充分利用新酶：“我們很高興ScCas9能夠進(jìn)入基因組編輯應(yīng)用家族，并希望獲得有關(guān)它們的反饋。”