前言

 

多種證據(jù)表明循環(huán)EV參與生理和病理環(huán)境中的細(xì)胞-細(xì)胞通訊。盡管現(xiàn)在他們的細(xì)胞生物學(xué)在體外得到了更好的了解，但由于缺乏適應(yīng)小型EV的動(dòng)物模型，它們?cè)趶?fù)雜生物體中如何在亞細(xì)胞水平上表現(xiàn)仍然難以評(píng)估。斑馬魚胚胎允許循環(huán)EV從其原始細(xì)胞到其靶細(xì)胞的可視化，并允許在發(fā)育或腫瘤進(jìn)展期間進(jìn)一步探索它們的命運(yùn)和功能。在未來，斑馬魚系統(tǒng)肯定有助于擴(kuò)展在整個(gè)生物體水平上的EVs知識(shí)。

 

細(xì)胞外囊泡（EV）在所有生物的體液中循環(huán)，它們參與細(xì)胞間跨器官交流。跟蹤和理解這些納米尺寸的物體一直受到成像技術(shù)的低分辨率和缺乏適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型的阻礙。斑馬魚胚胎的使用允許使用光學(xué)和電子顯微鏡以前所未有的時(shí)空分辨率觀察EV。這使得能夠并排研究?jī)?nèi)源性生理EV和病理性EV，并進(jìn)一步揭示其在整個(gè)生物體中的生物發(fā)生，生物分布和靶細(xì)胞的機(jī)制。這些發(fā)展將有助于更好地理解EV的體內(nèi)生理學(xué)。

 

生物發(fā)生和分泌

 

EV是膜囊泡的異質(zhì)集合，其富含蛋白質(zhì)，遺傳物質(zhì)和脂質(zhì)的子集，反映了細(xì)胞類型和起源細(xì)胞的生理狀態(tài)。它們來自晚期內(nèi)體-通常被稱為外泌體-或直接從質(zhì)膜（PM）發(fā)芽，在這種情況下它們被稱為微泡。除EV家族的這兩個(gè)主要成員外，還描述了其他細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，如凋亡小體，外顯子，以及斑馬魚胚胎中涉及的migrasomes，并已在人血清中檢測(cè)到。8月7日巴黎圣安妮大學(xué)精神病學(xué)和神經(jīng)科學(xué)團(tuán)隊(duì)在Trends in Cell Biology查看期刊詳情上發(fā)表了“Extracellular Vesicles: Catching the Light in Zebrafish”，本綜述主要關(guān)注外泌體和微泡。

 

 

EV最近的進(jìn)展以深入描述EV的各個(gè)亞群已經(jīng)導(dǎo)致建立了一個(gè)共同的命名法，以通過它們的大?。ù蠛托V）或它們的起源（外泌體與微泡）來區(qū)分EV亞群。然而，尺寸，密度和組成通常在EV亞群之間重疊。因此，仍然完全確定PM衍生的小EV與組織或功能中的內(nèi)體衍生的EV的差異程度。外泌體和微泡對(duì)體內(nèi)EV總量的各自貢獻(xiàn)同樣仍然是未解決的問題。它們?cè)隗w液中的高豐度與建議的短半衰期相結(jié)合表明體內(nèi)持續(xù)分泌。盡管如此，各種報(bào)告表明EV可能以組成型和誘導(dǎo)型方式釋放，并且可能依賴于細(xì)胞類型。了解EV生物發(fā)生，攝取和功能已經(jīng)從體外和體內(nèi)研究中獲益。然而，EV分泌的實(shí)時(shí)可視化長(zhǎng)期以來是不可能的，這阻礙了細(xì)胞類型和組織中EV生理釋放和攝取率的仔細(xì)評(píng)估。因此，對(duì)體內(nèi)EV半衰期的詳細(xì)分析以及對(duì)不同EV生物發(fā)生和釋放機(jī)制的相對(duì)貢獻(xiàn)的仔細(xì)評(píng)估已經(jīng)落后。最近開發(fā)的方法現(xiàn)在允許通過體外和體內(nèi)的單細(xì)胞可視化EV釋放，即使可視化體內(nèi)釋放過程本身仍然在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。

 

具體地說，外泌體報(bào)告基因CD63-pHluorin的組織特異性表達(dá)揭示了發(fā)育中的斑馬魚胚胎以同線蛋白-a依賴性方式分泌大量外泌體。在這種情況下，斑馬魚模型增加了之前在體外描述的EV生物發(fā)生途徑的極少數(shù)體內(nèi)研究。通過利用斑馬魚中的組織特異性啟動(dòng)子，可以使用類似的方法來確定體內(nèi)每個(gè)組織的外泌體和微泡的生理分泌速率和局部擴(kuò)散。有趣的是，循環(huán)EV的水平隨著生理狀態(tài)的變化或在各種病理發(fā)展期間而增加。因此，當(dāng)擾亂體內(nèi)平衡和/或EV間隙受到干擾時(shí)，EV分泌水平可能會(huì)增加。這些假設(shè)現(xiàn)在可以使用已建立的斑馬魚病理模型來解決，其中已知EV發(fā)揮核心作用?？傮w而言，EV釋放的體內(nèi)成像將有助于在生理和病理?xiàng)l件下確認(rèn)并進(jìn)一步探索EV分泌組織。

 

Figure 1：斑馬魚，解除體內(nèi)細(xì)胞外囊泡（EV）的秘密的新模型。

 

運(yùn)輸：身體流體的傳播和行為

 

高時(shí)空分辨率的體內(nèi)成像可以揭示EV如何在分泌細(xì)胞周圍擴(kuò)散，它們?nèi)绾未┻^生物屏障，以及最終它們?nèi)绾卧谕ㄟ^身體傳播之前到達(dá)循環(huán)。在體內(nèi)，大多數(shù)細(xì)胞不與血液直接接觸，而是與間質(zhì)液隔室構(gòu)成，其占細(xì)胞外總體液體積的約75％。有趣的是，在斑馬魚胚胎的間質(zhì)液中可以發(fā)現(xiàn)大量的內(nèi)源性YSL外泌體。因此，這個(gè)隔間可能是被忽視的EV儲(chǔ)存器，并且可能在體內(nèi)平衡或病理學(xué)中起重要作用。它可能作為EV向血管或淋巴管的運(yùn)輸途徑，最近已被證明含有大量的EV?；蛘?，EV可通過其他機(jī)制到達(dá)遠(yuǎn)離血管的細(xì)胞。實(shí)際上，多項(xiàng)體內(nèi)研究表明，EVs可以跨越細(xì)胞屏障，但所涉及的確切機(jī)制仍有待確定。這在已知血管異常可滲透的癌癥中尤其相關(guān)。

 

在這種情況下，斑馬魚胚胎提供復(fù)雜和刻板的血管網(wǎng)絡(luò)，適用于循環(huán)中EV的行為及其遠(yuǎn)程分散的精細(xì)解剖。血液中EV的快速成像顯示，與大血細(xì)胞相比，EV跨越血管的整個(gè)寬度。這種特殊的分布可能會(huì)影響EVs的停滯和內(nèi)化，而EV的進(jìn)一步由其表面粘附分子介導(dǎo)。此外，發(fā)現(xiàn)循環(huán)EV在靜脈區(qū)域比在動(dòng)脈中更有效地停滯，這表明流動(dòng)力直接影響它們靶向特定血管區(qū)域的能力。

 

攝取：細(xì)胞識(shí)別和機(jī)制

 

在小鼠中-檢測(cè)靈敏度有限-注入血液循環(huán)的EV積聚在少數(shù)特定器官中。此外，據(jù)報(bào)道，特定器官靶向取決于存在于腫瘤EV表面的整聯(lián)蛋白庫。需要進(jìn)一步的工作來描述EV負(fù)載的整合素如何機(jī)械地確定這種特異性。這可能是由于器官依賴性富集粘附分子，或另外-這種有機(jī)體性可以通過（i）EV注射部位，（ii）血流特征，（iii）EV逃避非特異性清除的能力或（iv）滲透性來解釋。大部分器官仍然形成的斑馬魚胚胎的大小和透明度，使得能夠?qū)崟r(shí)更好地了解EV生物分布。有趣的是，體內(nèi)大部分內(nèi)源性釋放的外泌體以及注射到斑馬魚胚胎中的預(yù)標(biāo)記腫瘤EV被尾靜脈叢吸收。CVP高度富集清道夫內(nèi)皮細(xì)胞，使人聯(lián)想到哺乳動(dòng)物肝臟內(nèi)的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。此外，這個(gè)血管區(qū)域顯示出較慢的血流動(dòng)力學(xué)，從而促進(jìn)EV停滯。利用斑馬魚模型系統(tǒng)的高時(shí)空分辨率，通過使用動(dòng)力蛋白抑制劑和體內(nèi)應(yīng)用的清道夫受體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑進(jìn)一步證明，這些內(nèi)皮細(xì)胞的EV攝取可能是由發(fā)動(dòng)蛋白中的清道夫受體介導(dǎo)的。值得注意的是，參與靶細(xì)胞的受體和特異性表面EV蛋白之間的相互作用可能導(dǎo)致信號(hào)通路的直接激活，并可能嚴(yán)重影響這些EV的命運(yùn)。實(shí)際上，EV的子集可以通過將信號(hào)傳遞給位于靶細(xì)胞PM的受體來發(fā)揮其主要功能。

 

這些研究同樣表明通過巡邏CVP血管腔中存在的巨噬細(xì)胞有效攝取EV。這種攝取可能通過絲狀背斜和巨噬細(xì)胞增多癥發(fā)生。受體表達(dá)的遺傳干擾或其體內(nèi)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)可以提供對(duì)這些過程的更多洞察。最后，由于病理性EV的持續(xù)分泌水平導(dǎo)致的清除機(jī)制的破壞或飽和可能擴(kuò)大靶細(xì)胞的范圍，從而“改變”這些EV的病理作用。在這方面，體內(nèi)EV分泌水平的生理或病理水平的近似可能證明對(duì)于真正理解它們的重要性是關(guān)鍵的。因此，斑馬魚中高分辨率的實(shí)時(shí)成像可以幫助進(jìn)一步解釋EV隨時(shí)間的細(xì)胞類型特異性靶向，以及它們?cè)赑M和所涉及的受體上的停留時(shí)間的細(xì)節(jié)。此外，它將允許詳細(xì)分析它們?cè)隗w內(nèi)亞細(xì)胞水平的攝取和運(yùn)輸。

 

命運(yùn)：退化，反向融合和消息傳遞

 

內(nèi)化后，EVs遵循三種可能的命運(yùn)：（i）運(yùn)輸至溶酶體-導(dǎo)致其內(nèi)容物退化/再循環(huán); （ii）EV與后內(nèi)體的限制性膜的反向融合-導(dǎo)致EV貨物遞送至細(xì)胞質(zhì)和/或?qū)⑼鈦眢w跨膜蛋白整合到宿主細(xì)胞膜中; （iii）EV的分泌?；蛘撸珽Vs可以與接收PM融合以運(yùn)送貨物，但大多數(shù)報(bào)告表明貨物運(yùn)輸前的吸收。由于目標(biāo)細(xì)胞中EV的命運(yùn)將直接影響其功能，因此與EM結(jié)合的實(shí)時(shí)成像可以成為進(jìn)一步破譯EV生理學(xué)這一方面的有力工具。通過使用標(biāo)記有pH敏感和非pH敏感標(biāo)記物組合的EV標(biāo)記物與pH敏感性組合，體內(nèi)成像可用于證明向晚期內(nèi)體區(qū)室的運(yùn)輸。有趣的是，最近使用13C標(biāo)記的同位素標(biāo)記的報(bào)告表明，被溶酶體降解的EV貨物可以被細(xì)胞重新利用。在斑馬魚胚胎發(fā)育的背景下，CVP的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)YSL衍生的內(nèi)源性EV的攝取和溶酶體降解顯示提供營(yíng)養(yǎng)支持。即便如此，通過EV的降解，向溶酶體區(qū)室的運(yùn)輸可能并不僅僅與營(yíng)養(yǎng)支持有關(guān)。使用相關(guān)光學(xué)和CLEM證實(shí)了巡回巨噬細(xì)胞的晚期內(nèi)體/溶酶體內(nèi)化EV的積累。這種方法可以在斑馬魚中有效地進(jìn)行，從而解鎖與功能性貨物轉(zhuǎn)移到接收細(xì)胞有關(guān)的一些剩余秘密。盡管它們被分選到溶酶體區(qū)室，腫瘤EV確實(shí)可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，這表明EV信息/內(nèi)容的轉(zhuǎn)移可能在該過程的某個(gè)步驟發(fā)生。同樣，在不久的將來，通過跟蹤EV攝取和調(diào)節(jié)后接收細(xì)胞的表型變化，可以直接在斑馬魚中評(píng)估EV的功能影響，擴(kuò)展到其他生物學(xué)問題。

 

結(jié)論

 

盡管最近取得了重大進(jìn)展，但外泌體和其他體內(nèi)EV的確切相關(guān)性仍然模糊不清。此外，雖然病理學(xué)，特別是癌癥，被廣泛研究，但正常生理學(xué)中EV的確切功能仍然難以捉摸。解決這些問題需要模型系統(tǒng)，允許高分辨率動(dòng)態(tài)觀察EV釋放，運(yùn)輸和攝取，以及調(diào)整EV釋放和定位的工具。嚙齒動(dòng)物模型還沒有適應(yīng)這樣的任務(wù)，無脊椎動(dòng)物模型，盡管有其他優(yōu)點(diǎn)，大多缺乏類似于人類的循環(huán)系統(tǒng)。相比之下，斑馬魚胚胎具有許多優(yōu)勢(shì)，包括快速發(fā)育，低成本，基因改造的適應(yīng)性和自然透明度-允許非侵入性成像-和血管網(wǎng)絡(luò)。通過將高速體內(nèi)顯微鏡與EM分析相結(jié)合，他們成功地允許以高時(shí)空分辨率探測(cè)單個(gè)EV。與高時(shí)空分辨率成像兼容的體內(nèi)方法，現(xiàn)在可以在斑馬魚胚胎中使用，將有助于解開EVs的旅程和功能的基本方面。