專家點評Nature背靠背 |浙大教授解釋基因敲除為何沒有表型
發(fā)布時間:
2019-07-18
Robustness指一個復雜系統(tǒng)適應和應對內(nèi)部和外界擾斷而行使正常功能的能力。遺傳系統(tǒng)健壯性（genetic robustness）指一個生命體能緩沖基因組中有害突變的能力。突變是生命進化的原動力，而有害突變是致死。一個穩(wěn)定的遺傳系統(tǒng)既能緩沖突變同時進行世代更迭，這樣本體能維持正常功能，突變在代際間傳遞和累積給予了生物系統(tǒng)進化發(fā)展的空間【1】。遺傳穩(wěn)定性可由多種機制介導：1. 遺傳冗余基因（genetic redundancy）可替代失活基因行使正常功能；2. 遺傳網(wǎng)絡的重整（rewiring genetic network）也可以應對變化/擾動；3. 酵母中發(fā)現(xiàn)了適應突變（adaptive mutations: 相應突變來應對致死突變而得以生存）【2】。
015年，德國馬普學會Didier Stainier教授報道斑馬魚中一種遺傳補償效應（genetic compensation）【2】。斑馬魚中，科學家使用Morpholino來阻斷mRNA翻譯進行基因功能缺失的研究。Stainier教授用Morpholino阻斷基因egfl7的翻譯，觀察到血管網(wǎng)絡系統(tǒng)異常。而當他們檢測egfl7基因的一種缺失突變時，該突變體卻一切正常沒有與Morpholino實驗相似的表型！進一步實驗表明該缺失突變體中egfl7基因RNA水平極低，但與之功能相似并序列同源的emilin系列基因表達上升，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄水平的適應（adaption）反應，這些基因的表達補償了egfl7功能的缺失。遺傳補償效應只在這種缺失突變體觀察到（圖1）。顯性失活（dominant negative）突變體、morpholino處理，以及CRISPR技術阻斷轉(zhuǎn)錄延長實驗均不能進行遺傳補償。在多個基因，在老鼠和擬南芥中均發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，表明遺傳補償是一種普遍的現(xiàn)象，但分子機制不清楚。
圖1 TALEN造成egfl基因第三個外顯子3/4bp的缺失，形成了egfl7 mRNA在氨基酸第49位提前終止密碼子。
2019年4月4日，Nature背靠背在線發(fā)表了浙江大學陳軍教授和Stainier教授的研究成果，揭示了遺傳補償效應的分子機制。研究表明這些沒有表型的基因突變均可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生無義mRNA，無義mRNA引起相應降解（non-sense mRNA mediated decay，NMD）。介導NMD的Upf3a蛋白可以和COMPASS復合物直接作用，激活同源基因的表達，進行功能補償。這是首次發(fā)現(xiàn)基因突變產(chǎn)生的無義mRNA降解直接介導對同源基因位點進行表觀遺傳調(diào)控，激活其表達。
這一分子機制的闡明將有助于我們理解遺傳操作實驗的一些看似相悖的結(jié)果，同時提供一種全新的思路解釋和治療人類的某些遺傳病（見專家點評）。陳軍教授的研究在斑馬魚中完成，Stainier教授同時進行了斑馬魚和老鼠的實驗。下面將主要解讀陳軍教授的實驗。
斑馬魚中，Morpholino抑制capn3a基因功能造成肝臟縮小，而capn3a一個14bp缺失突變體（Δ14）卻表型正常。該缺失突變體造成氨基酸第60位沉默突變即一個提前終止密碼子，capn3 mRNA水平也非常低，顯示是一個完全功能缺失突變。作者同時檢測19個capn3同源基因發(fā)現(xiàn)有共計10個同源基因的mRNA水平升高，capn8和capn12的表達增加最多（圖2），但是Morpholino組沒有這些基因表達升高。作者推測是無義mRNA降解（NMD）引起的。為了驗證推測，作者繼續(xù)構(gòu)建了多個capn3基因不同位點的沉默突變，可能引起NMD。實驗表明，不同位點的沉默突變可有不同的補償效果。有75%位點的沉默突變沒有肝臟縮小表型，激活了同源基因的表達。這一補償效應有序列特異性，只引起同源基因的表達升高。capn3無義RNA不能引起別的基因的表達上升。同時capn3a轉(zhuǎn)錄本水平越低，同源基因的表達越高。進一步分析顯示，補償效應的產(chǎn)生需要這些無義RNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進一步提示了NMD的存在。
圖2 capn3a缺失突變的無義RNA降解造成capn8和capn12基因表達升高，進行遺傳補償。
無義mRNA降解（NMD）由Upf1，Upf2和Upf3蛋白結(jié)合在外顯子連接部位，觸發(fā)RNA降解。Upf3b活躍參加介導了NMD，而在其他研究中upf3a沒有NMD作用，甚至顯示相反效果。本文構(gòu)建了upf3a（-）；capn3a（Δ14）雙缺失突變體，斑馬魚呈現(xiàn)了capn3a功能缺失的肝臟縮小表型，沒有了遺傳補償，揭示了upf3a介導了遺傳補償效應。
COMPASS復合物（complex of proteins associated with Set1）可對轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）進行組蛋白H3K4的三甲基化，激活基因轉(zhuǎn)錄起始。upf3amorpholino對capn3a（Δ14）胚胎處理后，可見在capn8和capn12基因TSS位點組蛋白H3K4的三甲基化水平的降低。Upf3a蛋白可和COMPASS復合物Wdr5蛋白直接作用，并和Rbbp5蛋白發(fā)生聯(lián)系，形成Upf3a-Wdr5-Rbbp5的復合物，激活基因轉(zhuǎn)錄。Morpholino阻斷wdr5功能，可抑制遺傳補償效應，表明COMPASS復合物在遺傳補償作用中是必需的。
Stainier教授文中還提到了一個有趣的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染相應基因的短RNA片段同樣可以上調(diào)該基因的表達。更近一步，降低基因反義RNA （antisense transcript）具有相同的效果。這預示著基因轉(zhuǎn)錄可以同時影響基因表觀遺傳水平的調(diào)控。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1057-y
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1064-z
參考文獻：
1. Kitano, H. Biological robustness，Nature Reviews Genetics, 5:827 (2004)
2. Rossi, A. et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature ,524:230 (2015).
專家點評：
孫永華（國家斑馬魚資源中心主任）
遺傳補償是指機體中特定基因發(fā)生功能喪失型的序列突變后，導致該基因家族的其他成員表達上調(diào)，從而彌補特定基因功能的遺傳學現(xiàn)象。遺傳補償現(xiàn)象廣泛存在于動植物，如擬南芥、斑馬魚、小鼠甚至是人類中，被認為是生物在進化中為了應對基因突變而產(chǎn)生的遺傳耐受，其通常發(fā)生于基因敲除而非基因敲降個體中。近年來，隨著基因組編輯技術的迅速發(fā)展，利用反向遺傳學手段系統(tǒng)構(gòu)建突變體研究基因的在體功能成為可能，然而出乎意料的是眾多基因的突變并不會導致明顯的表型缺陷。例如，在斑馬魚中，超過80%的基因突變并不會出現(xiàn)明顯的表型。因此，學術界對遺傳補償?shù)年P注度越來越高。這兩篇發(fā)表于Nature的論文利用斑馬魚或小鼠培養(yǎng)細胞模型，在不同的層面闡釋了誘發(fā)遺傳補償效應的可能的分子機制。
德國馬普研究所Didier Y. R. Stainier實驗室詳細論證了無義介導的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）對誘發(fā)遺傳補償?shù)闹匾裕焊蓴_NMD途徑的重要因子upf1的表達會降低遺傳補償效應；在野生型胚胎中過表達未加冒的RNA（這種RNA在體內(nèi)會快速被5’-3’核酸內(nèi)切酶降解）會導致遺傳補償效應的出現(xiàn)；缺失基因的啟動子區(qū)或整個基因座位（沒有突變mRNA的降解）并不會導致遺傳補償效應。同時，他們的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生補償?shù)幕蛲ǔＥc突變mRNA具有高度的序列相似性，且補償基因的高表達與其轉(zhuǎn)錄起始位點處的組蛋白H3K4me3修飾有關。
更進一步，浙江大學陳軍實驗室和彭金榮實驗室合作發(fā)現(xiàn)，當且僅當轉(zhuǎn)錄的mRNA攜帶提前終止密碼子（premature termination codon，PTC）才會誘導遺傳補償效應，如果突變位點位于基因的最后一個外顯子則不會誘發(fā)遺傳補償，非常有意思的是他們還證明只有攜帶PTC和同源序列的轉(zhuǎn)基因才能激活體內(nèi)同源基因的表達，而注射體外合成的mRNA并不具備這樣的功能。他們的研究進一步發(fā)現(xiàn)，介導NMD的upf1或upf3b都不參與遺傳補償效應的產(chǎn)生，而同家族的upf3a直接參與誘導遺傳補償效應：Upf3a蛋白結(jié)合在攜帶PTC的無義mRNA上，招募Wdr5-COMPASS復合體至同源基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，促進核小體H3K4位的3甲基化，激活同源基因的表達，從而產(chǎn)生遺傳補償。如果無義mRNA與Upf3b結(jié)合，則會招募Upf2和Upf1使無義mRNA進入NMD途徑。
這兩份工作分別從NMD發(fā)生和無義 mRNA產(chǎn)生的角度，揭示了遺傳補償效應發(fā)生的可能分子機制。它們的共同點在于：1) 均強調(diào)無義mRNA對于遺傳補償發(fā)生的必要性；2)發(fā)生補償?shù)幕蛲ǔＥc突變RNA具有序列相似性；3)補償基因的激活表達與其轉(zhuǎn)錄起始序列處的H3K4me3修飾相關。不同點在于，浙大工作認為無義突變mRNA并非只是簡單地被NMD途徑降解，部分無義突變mRNA會與Upf3a招募COMPASS復合體，激活同源基因的表達。
遺傳補償?shù)姆肿訖C制的揭示對于如何阻斷遺傳補償以研究基因功能，或者激活遺傳補償以實現(xiàn)對突變導致的遺傳疾病的治療均提供了全新的思路。例如為了更好地研究基因功能，通過敲除啟動子區(qū)阻斷突變RNA轉(zhuǎn)錄，或針對編碼重要功能域的最后一個外顯子創(chuàng)造突變，都可以有效地避免遺傳補償效應；另一方面，通過敲除/敲降upf3a也可以阻斷遺傳補償?shù)?。對于錯義突變所導致的遺傳疾病的治療，則可以考慮在突變基因中人為制造PTC或轉(zhuǎn)基因引入PTC來誘發(fā)機體產(chǎn)生遺傳補償，從而達到基因治療的目的。
總之，遺傳補償分子機制的發(fā)現(xiàn)具有重大科學意義。當然，這一領域仍然有一些亟待回答的科學問題。例如，在同一基因家族的多個成員間，發(fā)生遺傳補償是否具有基因或序列特異的選擇性？為什么有些無義mRNA突變會導致遺傳補償，另一些突變又不導致補償效應？是否存在過度遺傳補償，以及什么情況下可能出現(xiàn)過度補償?shù)男?/span>
徐鵬飛（浙江大學醫(yī)學院，百人計劃研究員）
對于一些尚沒有胚胎干細胞（ESCs）系的模式生物如斑馬魚等來說，利用同源重組的方法建立基因敲除模型一直是一項困難的任務，因此Morpholino（是把核苷酸上的五碳糖環(huán)用一個嗎菲林（morpholino）取代，同時對磷酸基團也做了改變，使其可以以堿基配對的方式與體內(nèi)的目的基因mRNA 結(jié)合，抑制蛋白翻譯，達到瞬時敲低基因表達的目的，在斑馬魚、爪蟾和雞胚等模式生物中得到廣泛應用）等基因敲低技術一直是一種簡便快捷的研究基因功能的手段，直到TALEN、Crispr-Cas9等基因編輯技術的出現(xiàn)，人們終于可以在斑馬魚等模式生物中高效的實現(xiàn)基因敲除，建立小鼠基因敲除模型的效率也大大提高了。大家在為之興奮的同時，很多實驗室（尤其是斑馬魚實驗室）都多多少少遇到了相同的問題：基因敲除模型與Morpholino敲低模型不一致，甚至敲低表型在基因敲除模型中徹底消失。這個問題造成了很大的困擾：這種現(xiàn)象是因為Morpholino的脫靶效應引起的？難道之前很多的基因敲低工作都是錯的？抑或是在遺傳水平上完全缺失某些基因啟動了全新的機制所導致？
針對這些問題，科學家們進行了深入的探索，之前已有一些工作表明遺傳敲除某些基因會啟動某種代償機制，對缺失的基因，其同源基因會在突變體中的表達量上調(diào)，從而補償其功能，而達到維持機體正常生理功能的目的【1,2】！但其機制并未闡明。
4月4日Nature在線背靠背發(fā)表的來自浙江大學生命科學學院的陳軍老師和彭金榮老師實驗室的工作，和來自德國馬克普朗克研究所的Didier Stainier實驗室的工作分別對其機制進行了研究【3,4】。陳軍、彭金榮老師研究組首先針對capn3a和nid1a兩個基因，用一系列漂亮的突變體結(jié)合轉(zhuǎn)基因斑馬魚系證明了基因突變導致的遺傳補償機制（Genetic Compensation Response，GCR）是依賴于突變所造成的蛋白翻譯未成熟提前終止信號（premature termination codon，PTC），這種提前終止會導致突變基因的同源基因上調(diào)，從而導致敲低capn3a導致的肝臟變小以及nid1a敲低所導致的體長變短兩個表型在其各自的突變體中消失；進一步的研究證明該補償機制依賴于Upf3a蛋白介導的一種存在于真核生物中重要的RNA監(jiān)控機制- “無義介導的mRNA降解”信號通路（nonsense-mediated mRNA decay，NMD），但并不依賴于同樣參與NMD的Upf1和Upf3b，有意思的是，Upf3a介導的基因代償，并非使突變mRNA降解，相反的，是保護其不被降解（這與同期發(fā)表的另一篇文章的機制正好相反）；陳、彭研究組進一步證明，Upf3a誘導遺傳補償?shù)臋C制是其與COMPASS復合體結(jié)合，從而增加相關同源基因在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的H3K4三甲基化水平，而最終使這些基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)（下圖），而被保護的突變基因可能起到識別、并招募Upf3a及COMPASS復合體至其同源基因轉(zhuǎn)錄起始位點附近的作用。
同期背靠背發(fā)表的另一篇文章利用斑馬魚和小鼠模型，同樣闡明了PTC介導的依賴于NMD的基因代償機制，同樣需要COMPASS介導的H3K4三甲基化參與，最大的不同是，Stainier組所闡述的機制依賴于突變mRNA的降解，而不是保護（下圖），可能的原因是否是因為不同的組織所利用的遺傳代償機制有所不同？（前一篇文章兩個基因分別影響肝臟和體長發(fā)育，后一篇文章主要關注了細胞的形態(tài)和斑馬魚血管）
綜上所述，這兩篇文章解決了困擾很多研究組的一個難題，為辛辛苦苦獲得了突變體而發(fā)現(xiàn)表型沒了的實驗室重新帶來了希望，因此相信一段時間內(nèi)陳、彭老師的Upf3a突變體會非常搶手。另外，像這兩篇文章中提到的，這也許可以為基因突變所導致的一些疾病帶來新的治療策略，同時，這兩篇文章也引出了一些很有意思的問題，如：COMPASS在特定基因的突變體中如何實現(xiàn)特異性的識別其同源基因的，突變mRNA如何識別其同源基因的轉(zhuǎn)錄起始位點？是否有更多的表觀遺傳調(diào)控機制參與？以及為什么只有部分基因存在代償機制，該代償機制是否存在細胞或組織特異性等。
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