撰文 | 章臺柳

責編 | 兮

 

基因編輯的免疫細胞已經(jīng)作為“活體藥物”用于血液腫瘤的治療?；蚓庉嫾毎氖讉€成功案例就是利用病毒載體插入CAR（chimeric antigen receptor），使自體T細胞獲得靶向腫瘤抗原的特異性。CAR-T細胞成功的臨床案例證明在體外進行基因修飾是安全可實現(xiàn)的，且具有顯著的持久的抗腫瘤效果。CAR-T在治療血液腫瘤上效果顯著，靶向CD19的CAR-T用于治療復發(fā)難治性急性淋巴細胞白血病，緩解效率達到80%。為了擴展CAR-T在其他疾病的使用，研究人員在靶向抗原、與小分子藥物等傳統(tǒng)治療方法的聯(lián)合、下一代CAR的開發(fā)等方面進行積極探索。

 

2019年6月3日，來自哈佛醫(yī)學院和麻省綜合醫(yī)院的Stefanie R. Bailey和Marcela V. Maus在Nature biotechnology雜志上發(fā)表綜述文章Gene editing forimmune cell therapies，詳細討論了基于免疫細胞（包括T、NK、單核細胞）、造血干細胞HSCs、誘導多能干細胞開發(fā)的細胞療法中目前使用的合成生物學和基因編輯的策略及未來發(fā)展方向；探討了細胞治療在腫瘤、免疫耐受、感染性疾病和再生醫(yī)學中的潛在利用價值。

 

 

 

目前免疫細胞的基因編輯大多聚焦于T細胞，主要基于天然TCRs和抗體-T細胞信號結(jié)構(gòu)域融合成CAR兩種方式，靶向腫瘤抗原。抗原受體天然以TCRs和抗體兩種形式存在。TCRs表達于T細胞中，識別主要組織相容性復合體MHC所遞呈的多肽，使得T細胞能夠靶向胞質(zhì)蛋白。TCR-T細胞的靶標主要針對自身譜系抗原（self-derived-lineage antigens），如黑色素瘤的MART-1（melanoma antigen recognized by T cells 1）、結(jié)直腸癌的CEA（carcinoembryonic antigen），癌癥-睪丸抗原中的NY-ESO-1。遺憾的是，目前僅有NY-ESO-1 TCR-T能夠很好的耐受，MART-1 TCR對眼睛、耳朵、皮膚產(chǎn)生on-target毒性，CEA TCR對結(jié)腸產(chǎn)生on-target毒性。在上皮癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌的臨床試驗中發(fā)現(xiàn)具有識別突變抗原（neoepitopes）TCR的TIL具有治療癌癥的潛在價值，但是腫瘤逃逸依然存在。使用靶向KRAS G12D的TIL（tumor-infiltrating T lymphocytes）治療轉(zhuǎn)移性肺癌患者【1】，開始腫瘤進展得到控制，隨后一例患者的腫瘤細胞通過丟失編碼HLA的等位基因進行逃逸。美國國家癌癥中心最近開展了鑒定并使用neoantigen特異的TCRs治療多種實體瘤的臨床試驗（NCT03412877）。突變特異性TCRs治療或?qū)⒊蔀樽罱K的個性化腫瘤特異性免疫治療。但是每個病人的腫瘤突變具有獨特性，尋找個性化TILs，測序并克隆TCRs，轉(zhuǎn)染T細胞，整個過程目前不能自動化操作，依賴于專家個人的經(jīng)驗，時間和費用將是TCR-T推廣和量產(chǎn)所面臨的最大挑戰(zhàn)。

 

傳統(tǒng)的CARs融合抗體的可變區(qū)和TCR信號分子，第二代CARs增加了共刺激分子的胞內(nèi)段，提高T細胞激活效率。與TCRs不同，CARs識別抗原不依賴于MHC，這也限制CARs只能識別細胞表面分子。CD19在正常B細胞表面很少表達，但普遍表達于B細胞惡性腫瘤，是CAR-T的理想靶標。CD19-CAR-T在臨床取得顯著的治療效果，對復發(fā)性或難治性急性淋巴細胞白血病的緩解超過80%，被FDA批準用于治療難治性B細胞白血病和淋巴瘤【2,3】。靶向BCMA（B cell maturation antigen）的CAR-T用于治療多發(fā)性骨髓瘤也正在開展臨床試驗。靶向其他抗原的CAR-T正在研發(fā)中，比如CD20（B細胞）、CS1（SLAMF7，漿細胞）、CD5（T細胞）、CD37（T和B細胞）等。但是所有的靶點都是譜系特異的，而不是腫瘤特異的，這就導致清除腫瘤細胞的同時，也清除一些必需的血液細胞；例如CD33 CAR-T用于治療髓系白血病時，必需的成熟粒細胞也被清除，可以利用基因編輯技術(shù)在自體HSC中敲除CD33后移植治療，以恢復正常的髓系細胞譜系。缺乏腫瘤特異性表面抗原限制CAR-T技術(shù)用于實體瘤治療。在腫瘤細胞上過表達的抗原如mesothelin和Her2，在正常組織中也有表達，這就會導致on-target毒性。少數(shù)嚴格限制在腫瘤中表達的抗原如膠質(zhì)母細胞瘤表達的EGFRvIII，則存在異質(zhì)性表達，限制了CAR-T的使用。

 

 

為了擴展CAR-T的治療領(lǐng)域，研究人員在CAR的設(shè)計上有眾多創(chuàng)新之舉。為了提高T細胞對腫瘤細胞殺傷的特異性，采取雙受體模式。Fedorov等設(shè)計了識別腫瘤抗原CAR，同時表達抑制性CAR，PD-1或CTLA-4，抑制CAR-T對正常組織的殺傷作用。Lim等的方案是抗原A的識別驅(qū)動靶向抗原B的CAR轉(zhuǎn)錄表達。為了解決腫瘤下調(diào)抗原或抗原表達抑制性導致的腫瘤逃逸，采用separate transduction、co-tranduction或者tandem CAR等技術(shù)同時靶向多個抗原或許是新的方向。目前20項臨床試驗正在開展以檢測同時靶向CD19/CD20及CD19/CD22的治療效果。腫瘤抑制性微環(huán)境是CAR-T應用于實體瘤的一大挑戰(zhàn)，編輯CAR-T使之能分泌anti-PD-L1、敲除PD-1的表達、IL-4-IL-7將IL-4抑制信號轉(zhuǎn)變成IL-7激活信號等或許能克服腫瘤抑制性作用。

 

目前在T細胞中表達CAR主要基于逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，但其轉(zhuǎn)基因的載量有限，隨著轉(zhuǎn)基因數(shù)目增加，病毒的滴度及轉(zhuǎn)導效率都減弱。為了克服這些問題，一些非病毒的基因編輯技術(shù)發(fā)展起來，如使用轉(zhuǎn)座子技術(shù)的Sleeping Beauty和piggyBac。使用Sleeping Beauty編輯的CD19+ CAR-T聯(lián)合自體或異體HSC移植達到總生存率100%及63%的治療效果。不過轉(zhuǎn)座子體系使用大量的DNA用于轉(zhuǎn)染，導致細胞活性下降，基因表達水平不高。病毒轉(zhuǎn)導體系存在另一問題是整合位點，逆轉(zhuǎn)錄病毒傾向整合到造血細胞的LMO基因位點，導致白血病的發(fā)生。整合位點會影響治療效果，一名患者經(jīng)整合到TET2基因的CD19-CAR-T治療后，獲得疾病的完全緩解。臨床前研究表明，使用TALENs（transcription activator–like effector nucleases）、homing ednonucleases、CRISPR-Cas9等技術(shù)將CAR特異性整合到特定的基因位點（如內(nèi)源TCR）不僅僅提高抗腫瘤治療效果，而且有助于“off-the-shelf”商品化CAR-T的生產(chǎn)。

 

 

 

基因編輯技術(shù)不僅應用于T細胞，在NK、巨噬細胞、造血干細胞和非造血干細胞中都有探索。NK細胞具有細胞溶解功能，抗病毒、抗腫瘤作用，因為缺乏導致GvHD（移植物抗宿主病）的TCR，更易制成“off-the-shelf”商品。臨床的前期數(shù)據(jù)表明商品化的CD19 CAR NK細胞治療B細胞惡性腫瘤具有安全性和有效性【4】。但是NK細胞轉(zhuǎn)染效率低、需要高濃度IL-2或者IL-15支持存活等特點是基因編輯NK細胞的困難之處。使用基因編輯技術(shù)，改變巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的抑制性作用主要通過以下途徑：分泌輔助T、NK的細胞因子如IL-21；下調(diào)抑制性基因IL-10和PD-L1的表達；降低‘don’t eat me’受體SIRP-α的表達，增強吞噬作用。誘導多能干細胞（iPSCs）和造血干細胞（HSCs）可以用來產(chǎn)生攜帶腫瘤特異性TCR或CAR的T細胞。產(chǎn)生的T細胞具有自我更新能力，能夠增強細胞的持久性，延長療效。但其副作用事件不得不考慮，除了CAR靶向相關(guān)的B細胞再生障礙性貧血及細胞因子釋放綜合癥，還有大量細胞分裂導致的基因組潛在改變及iPSCs不分化導致的細胞水平毒性。使用基因編輯技術(shù)改造非造血干細胞如NSCs（neural stem cells）和MSCs（mesenchymal stem cells），可以實現(xiàn)釋放有害于腫瘤生長的酶類、搭載前藥系統(tǒng)、遞送納米顆粒藥物、遞送抗腫瘤物質(zhì)如IFN、遞送溶瘤病毒等功能，抑制腫瘤生長。

 

 

基因編輯的免疫細胞不僅在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，而且具有應用于感染性疾病、移植排斥、自身免疫性疾病的潛在價值。例如編輯Treg細胞中表達TCR或CAR，或者表達免疫抑制性細胞因子如IL-10，抑制免疫反應，提高機體耐受。T細胞中表達抗自體抗體的CAR，直接殺傷自體反應B細胞，緩解自身免疫疾病。靶向CD4的CAR-T及基因編輯失活CCR5的T細胞不但干擾HIV的感染過程，而且殺傷HIV感染的細胞。目前一項利用基因編輯CAR+C34– CXCR4+CCR5+ T細胞治療HIV的臨床試驗正在開展。

 

總的來說，CD19-CAR-T在臨床上顯著的抗腫瘤效果促進免疫細胞編輯領(lǐng)域的快速發(fā)展，也推動CAR的設(shè)計和遞送系統(tǒng)領(lǐng)域的創(chuàng)新。在NK、巨噬細胞、干細胞等不同種類中的編輯更是將免疫細胞治療從抗腫瘤免疫擴展到感染性疾病、自身免疫病的治療。使用基因編輯技術(shù)改造免疫細胞具有非常可觀的應用前景。

 

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0137-8

 

制版人：小嫻子

 

 

參考文獻

 

 

1. Tran, E. et al.T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant KRAS in Cancer. N. Engl. J. Med. 375,2255-2262, doi:10.1056/NEJMoa1609279 (2016).

2. Maude, S. L. et al. Tisagenlecleucel inChildren and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.N. Engl. J. Med. 378,439-448, doi:10.1056/NEJMoa1709866 (2018).

3. Schuster, S. J. et al. Tisagenlecleucelin Adult Relapsed or Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma. N. Engl. J. Med.380, 45-56, doi:10.1056/NEJMoa1804980 (2019).

4. Liu, E. et al. Cord blood NK cellsengineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistenceand potent antitumor activity. Leukemia 32, 520-531, doi:10.1038/leu.2017.226(2018).