一般推薦MO + CRISPRi 兩種策略去同時(shí)敲降一個(gè)基因，由于MO是在轉(zhuǎn)錄后水平上敲降基因的功能，而CRISPRi 是在轉(zhuǎn)錄水平上敲降基因的功能，使用兩種獨(dú)立的、原理完全不同的敲降方法，如果給出的敲降效果（表型）是一樣的，那么這樣建立的敲降方法可以被認(rèn)可是有效且特異的。請大家注意：評價(jià)基因敲降效果需要從有效和特異兩個(gè)方面來考慮。有效性問題：CRISPRi敲降的有效性可以通過RT-PCR法檢測目標(biāo)基因表達(dá)水平是否被有效下調(diào)來進(jìn)行直接評價(jià)，而MO敲降的有效性，抑制翻譯的MO和抑制剪接的MO的評價(jià)方法不同。抑制剪接的MO的有效性可以通過RT-PCR直接檢測看原始mRNA的剪接是否被改變而確定；抑制翻譯的MO的有效性評價(jià)通常需要通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測---但是由于適用于斑馬魚的抗體很少，過去一般通過報(bào)告基因法來解決，但17年后來發(fā)表的Plos Genetics論文認(rèn)為這種報(bào)告基因評價(jià)法缺乏特異性，因而不再推薦該報(bào)告基因評價(jià)方法。也正是由于沒有相應(yīng)比較方便的評價(jià)方法，我們一般不推薦此抑制翻譯的MO敲降法。敲降策略的特異性則需要通過拯救的方法來回答。之所以需要拯救，是因?yàn)檫M(jìn)行基因敲降時(shí)可能由于敲降工具的脫靶或者敲降試劑本身的毒性導(dǎo)致敲降后看到的表型是非特異的（或者說表型是源于基因敲降工具的脫靶或者試劑本身的毒性所造成的）。拯救的基本實(shí)驗(yàn)策略是：在基因敲降的基礎(chǔ)上，過表達(dá)被敲降的基因（通常是同時(shí)顯微注射目標(biāo)基因的戴帽mRNA），然后觀測原來出現(xiàn)的表型是否被恢復(fù)（或有所恢復(fù)）至正常(參見我們發(fā)表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )。如果有很好的拯救，那么可以確認(rèn)，敲降方法是特異的。我們現(xiàn)在所主推的基于基因組編輯技術(shù)的CRISPRi敲降方法，一般同時(shí)注射4個(gè)sgRNA + dCas9-Eve mRNA。先前的很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單個(gè)sgRNA引導(dǎo)dCas9-Eve所發(fā)揮的抑制基因表達(dá)的功能遠(yuǎn)沒有多個(gè)sgRNA同時(shí)引導(dǎo)dCas9-Eve發(fā)揮的抑制功能強(qiáng)，這種多個(gè)sgRNA的協(xié)同作用決定了CRISPRi法脫靶作用可以忽略，而RNA本身的毒副作用是完全可以進(jìn)行對照的（大家應(yīng)該注意到，我們在進(jìn)行敲降實(shí)驗(yàn)時(shí)，有一組僅注射dCas9-Eve mRNA的對照）。而相對而言，MO的脫靶作用比較大，事實(shí)上，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明：即使有多達(dá)5 bp的錯(cuò)配，MO也會發(fā)生作用。而對于一個(gè)25 nt長的MO而言，5 bp錯(cuò)配在基因組涉及的類似序列可以是成百上千。除此以外，MO自身的毒性是無法進(jìn)行對照的（即使是同一種序列，不同批次合成的產(chǎn)品的毒性也可能是不一樣的，顯然，這種“內(nèi)在”的毒性是無法進(jìn)行對照的）。這也在某種程度上可以解釋為什么基因敲降與基因敲除的表型常常是不一樣的（參考我們發(fā)表的論文Li et al., J Biol Chem. 290(16):10216-28.）。雖然2015年的Science論文后來指出基因敲除與基因敲降后表型不一致的原因可能源于基因功能冗余和/或基因功能補(bǔ)償，但MO的有效性和特異性毫無疑問依然可能扮演著非常重要角色。因此，對于重要的基因（如果客戶期望要長期或重點(diǎn)研究），一般建議還是要制備一個(gè)基因敲除突變體魚系