澳門大學羅茜組構(gòu)建斑馬魚模型實現(xiàn)在單細胞水平實時觀察NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用

作者：luojiao 發(fā)布時間：2022/8/22 9:00:00

近年來，腫瘤免疫治療取得了十分重要的進展?；赥細胞和CAR T細胞的療法已經(jīng)在臨床上用于多種腫瘤的治療。然而，T細胞療法存在細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome）和移植物抗宿主病（graft versus host disease）等副作用。作為另外一種策略，基于NK細胞的腫瘤免疫療法逐漸吸引業(yè)界的關(guān)注。NK細胞可以不經(jīng)過抗原識別直接殺傷腫瘤細胞。相較T細胞而言，基于NK細胞的療法對健康組織的免疫攻擊更不易發(fā)生，副作用更小。為了增強NK細胞的殺傷效果，多種新型的治療性NK細胞正在被開發(fā)出來，比如臍帶血NK細胞，干細胞來源NK細胞，過繼性NK細胞，細胞因子誘導(dǎo)的記憶樣NK細胞和CAR NK細胞等。這些新型的治療性NK細胞的殺傷效果需要合適的動物模型來評價，可靠且簡便的動物模型能夠有效地促進NK細胞療法的開發(fā)。

NK細胞主要通過死亡受體途徑（death receptor pathway）和殺傷性顆粒途徑（cytotoxic granule pathway）介導(dǎo)的細胞凋亡來殺死腫瘤細胞。傳統(tǒng)常用的評價NK細胞殺傷效果的方法為鉻釋放試驗（chromium release assay）。該方法采用放射性同位素鉻標記靶細胞，靶細胞被NK細胞殺死后，根據(jù)靶細胞釋放的鉻來判斷NK細胞的殺傷活性。鉻釋放試驗可以較為準確的測定NK細胞對靶細胞的殺傷，但是，鉻的放射性影響了該方法的使用。鑒于此，具有熒光的鈣黃綠素（calcein）被用來替代鉻進行細胞標記。然而，鈣黃綠素對有些細胞的標記較差，且隨著細胞的增殖熒光會被稀釋，故不適合長時程跟蹤。

羅茜團隊在之前的研究中，利用基因工程技術(shù)，開發(fā)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的蛋白熒光探針sensor C3用于細胞凋亡的實時跟蹤。該探針在活細胞中發(fā)出綠色熒光，而在凋亡細胞中，構(gòu)成sensor C3的CFP和YFP之間的氨基酸序列被活化的caspase-3切割，F(xiàn)RET被中斷，從而探針發(fā)出藍色熒光。本研究中，基于sensor C3，并結(jié)合循環(huán)系統(tǒng)標記的斑馬魚Tg(fli1:EGFP)，該團隊建立了一種可以在體內(nèi)實時地觀察腫瘤細胞擴散和NK細胞殺傷的動物模型。作為一種強大的體內(nèi)工具，該模型可以用來評價基于NK細胞的免疫療法的治療效果。2022年8月6日，此項研究以“Visualization of natural killer cell-mediated killing of cancer cells at single-cell resolution in live zebrafish” 為題發(fā)表于國際知名期刊Biosensors and Bioelectronics上。

作者首先建立了體外3D培養(yǎng)模型來研究NK細胞對腫瘤細胞的殺傷（圖1）。作者使用sensor C3標記腫瘤細胞，紅色熒光蛋白（tdTomato）標記NK-92MI細胞，腫瘤細胞和NK細胞混合后，共同培養(yǎng)在非貼壁孔板。結(jié)果顯示，在腫瘤細胞單獨培養(yǎng)的對照組，很少出現(xiàn)藍色的凋亡細胞。而在共培養(yǎng)組，6小時后即出現(xiàn)大量凋亡細胞，36小時后，腫瘤細胞幾乎全被NK細胞殺死。
 

圖1 體外3D培養(yǎng)模型顯示NK細胞可以誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡

然后，作者將腫瘤細胞和NK細胞通過顯微注射的方法在總主靜脈（common cardinal vein, CCV）處注射到斑馬魚幼魚。注射后6小時，可以看到腫瘤細胞分散到軀干和尾部。在腫瘤細胞單獨注射對照組，很少有藍色凋亡細胞，而在共注射組，有大量凋亡細胞（圖2A）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，腫瘤細胞凋亡的峰值出現(xiàn)在注射后12小時，且NK細胞可以在36小時內(nèi)幾乎殺死全部腫瘤細胞 （圖2B, C）。
 

圖2 斑馬魚腫瘤模型顯示NK細胞對肺癌細胞的殺傷

大視野全身成像技術(shù)展示了顯微注射8小時后，腫瘤細胞在斑馬魚體內(nèi)的分布和NK細胞對腫瘤細胞的殺傷 （圖3A）。而高分辨率成像則更好地展示了NK細胞和腫瘤細胞的相互作用。比如，NK細胞會緊密地粘附腫瘤細胞，甚至會改變自己的形態(tài)來更好地殺傷腫瘤細胞（圖3B）。
 

圖3 大視野和高分辨成像顯示NK細胞對肺癌細胞的殺傷

為了研究NK細胞殺傷腫瘤細胞的動態(tài)過程，作者進行了實時成像（圖4）。如圖所示，在顯微注射4小時10分鐘后，一個NK細胞識別到一個乳腺癌細胞， 35 分鐘后，該乳腺癌細胞開始由綠變藍，意味著caspase-3的活化。4小時55分鐘后，腫瘤細胞徹底變?yōu)樗{色，同時NK細胞開始遷移向另外一個腫瘤細胞。
 

圖4 實時成像顯示NK細胞對乳腺癌細胞的殺傷

澳門大學健康科學學院羅茜教授為論文通訊作者，博士研究生楊紅梅和博士后研究員賈皓為論文共同第一作者，趙琦教授參與了相關(guān)研究工作。澳門大學健康科學學院動物研究核心實驗中心和生物成像及干細胞核心實驗中心提供了重要支持。這項研究得到了澳門大學MYRG研究基金和澳門大學健康科學學院的資助