中樞神經(jīng)系統(tǒng)在血液和腦組織的界面上具有一個選擇性的過濾屏障，這一結(jié)構(gòu)被稱為血腦屏障（BBB），血腦屏障在早期胚胎發(fā)育過程中逐漸建立，并通過功能整合的神經(jīng)血管單元來維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在很多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，神經(jīng)血管微環(huán)境被破壞，因此會出現(xiàn)液體、分子和細(xì)胞的過度浸潤，從而導(dǎo)致疾病惡化。血腦屏障功能障礙表現(xiàn)為不同程度的腦血管高通透性、神經(jīng)血管解偶聯(lián)或血流失調(diào)；其與中風(fēng)、膠質(zhì)瘤、癲癇、外傷性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[1-3]。血腦屏障破裂時，神經(jīng)毒性血漿成分滲漏、免疫細(xì)胞浸潤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)境改變。但血腦屏障又是多種疾病治療的“魔障”，由于分子選擇性的存在很難使得藥物發(fā)揮作用。因此，需要一定的治療策略來修復(fù)受損的血腦屏障功能。為此，比利時布魯塞爾自由大學(xué)Benoit Vanhollebeke研究組在Science發(fā)文題為Engineered Wnt ligands enable blood-brain barrier repair in neurological disorders，通過工程化的Wnt配體的方式促進(jìn)神經(jīng)功能障礙疾病中血腦屏障的的修復(fù)。
 

 

在多種控制神經(jīng)血管功能的信號途徑中，內(nèi)皮細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路作為血腦屏障生理的主要調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管侵襲的早期階段啟動血腦屏障分化級聯(lián)信號途徑，并在健康和疾病中維持血腦屏障功能。而血腦屏障成熟過程則是由Wnt7a/b配體所控制的[4-6]。因此，Wnt7a/b配體修復(fù)功能失調(diào)血腦屏障以及促進(jìn)成熟的功能成為了藥物開發(fā)的靶點(diǎn)。但是由于Wnt7a/b在體內(nèi)能夠與Frizzled受體混雜相互作用，會導(dǎo)致器官改變、干細(xì)胞異常擴(kuò)增以及腫瘤發(fā)生等等不良后果，比如當(dāng)Wnt7a在非洲爪蟾或斑馬魚胚胎中表達(dá)時，分別會導(dǎo)致前神經(jīng)系統(tǒng)的軸復(fù)制等，最終導(dǎo)致畸形發(fā)生。因此想要將Wnt7a/b為藥所用還有很長的一段路要走。

 

在大腦的內(nèi)皮細(xì)胞中有一個非典型的的Wnt7a/b特異性共受體復(fù)合物，在腦血管生成和血腦屏障調(diào)節(jié)過程中激活Wnt/β-catenin信號通路，其中含有糖基磷脂酰肌醇錨定型糖蛋白Reck和粘附G蛋白偶聯(lián)受體Gpr124，該復(fù)合體對Wnt7a/b具有高度特異性，為此作者們考慮是否可以通過該復(fù)合體的組裝協(xié)同刺激Wnt7a/b特異性反應(yīng)，而不引起其他的副作用。

 

因此，血腦屏障藥物開發(fā)的目標(biāo)可以由Wnt7a/b轉(zhuǎn)化為找到Gpr124/ Reck的特異性激動劑（圖1）。通過對Wnt7a進(jìn)行系統(tǒng)性突變，作者們發(fā)現(xiàn)改變Wnt配體的結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)其信號特異性，更具體地說，Wnt7a可以被設(shè)計(jì)成Gpr124/Reck特異性配體或者說激動劑。基于此概念，作者們找到一個目標(biāo)突變Wnt7aK190A。該突變的注射不會引發(fā)爪蟾或者斑馬魚體軸的改變。
 

圖1 鑒定發(fā)現(xiàn)Gpr124/ Reck的特異性激動劑
 

隨后，作者們對Wnt7aK190A進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)這一突變會影響其與Fz的相互作用，與此同時也提高了其穩(wěn)定性以及活性的維持，Gpr124/Reck會將Wnt7a/b招募到一個高階受體復(fù)合體中。為了對Wnt7aK190A在體內(nèi)的功能活性進(jìn)行檢測，作者們構(gòu)建了一個具有遺傳缺陷的斑馬魚模型。作者們敲除了Wnt7aa，該品系的斑馬魚表現(xiàn)出腦血管和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)發(fā)生缺陷（圖2），而這一缺陷可以通過一細(xì)胞期Wnt7aK190A mRNA注射而挽救，但是相同量的Wnt7a則具有毒性。通過血腦屏障成熟的細(xì)胞標(biāo)記物染色，作者們進(jìn)一步確認(rèn)Wnt7aK190A可以恢復(fù)血腦屏障的正常成熟過程。
 

圖2 Wnt7aa敲除斑馬魚品系表現(xiàn)出腦血管等缺陷
 

進(jìn)一步的， 作者們想知道Gpr124/Reck的激動劑能否在小鼠中發(fā)揮作用。為此，作者們使腺病毒相關(guān)病毒分別表達(dá)了Wnt7a以及Wnt7aK190A。作者們發(fā)現(xiàn)與Wnt7aK190A相比，Wnt7a會引發(fā)額外的Wnt/β-catenin信號通路活性。通過在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及中風(fēng)缺血模型中遞送Gpr124/Reck激活劑，作者們證明Wnt7aK190A的確能夠恢復(fù)血腦屏障損傷后的功能，恢復(fù)Wnt信號同路以及降低血管密度。
 

總的來說，作者們通過大規(guī)模的誘導(dǎo)鑒定發(fā)現(xiàn)了高度特異性活性的Gpr124/Reck激動劑Wnt7aK190A，該突變型Wnt7a在體內(nèi)耐受性良好，不會導(dǎo)致副作用，并且在腦腫瘤和缺血性中風(fēng)小鼠模型中對血腦屏障功能恢復(fù)具有明顯作用（圖3）。該研究揭示了Wnt配體的信號特異性的可調(diào)節(jié)性，并發(fā)現(xiàn)了一種通過調(diào)節(jié)血腦屏障功能的方式來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，為中風(fēng)、多發(fā)性硬化癥、癲癇、阿爾茨海默氏癥等神經(jīng)退行性疾病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的參考。
 

圖3 工作模型：Wnt7aK190A配體用于血腦屏障治療

 

由于該工作在臨床治療方面的巨大前景，同期刊發(fā)了觀點(diǎn)文章對其進(jìn)行評價(jià)，題為Repairing the blood-brain barrier，Wnt7a的單個氨基酸改變顯著增加了其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性，從而改善了斑馬魚和腫瘤生長和中風(fēng)時血腦屏障破壞的小鼠模型的預(yù)后，同時該工作也創(chuàng)造了一種新的藥物開發(fā)思路。
 

參考文獻(xiàn)：

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2. B. W. Chow, C. Gu, The molecular constituents of the blood brain barrier. Trends Neurosci. 38, 598–608 (2015). doi: 10.1016/j.tins.2015.08.003; pmid: 26442694

3. Z. Zhao, A. R. Nelson, C. Betsholtz, B. V. Zlokovic, Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell 163, 1064–1078 (2015). doi: 10.1016/j.cell. 2015.10.067;  pmid: 26590417

4. J. M. Stenman et al., Canonical Wnt signaling regulates organ specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science 322, 1247–1250 (2008). doi: 10.1126/ science.1164594;  pmid: 19023080

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6. J. E. Lengfeld et al., Endothelial Wnt/b-catenin signaling reduces immune cell infiltration in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E1168–E1177 (2017). doi: 10.1073/pnas.1609905114; pmid: 28137846