冠心病也稱為冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CHD），是由冠狀動脈狹窄、供血不足引起的心肌功能障礙和（或）器質(zhì)性病變[1]。目前冠心病的治療主要為藥物治療、介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）及冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）[2]。已有研究表明，傳統(tǒng)中藥可通過促進(jìn)心臟梗死區(qū)或缺血區(qū)的旁路血管新生來治療CHD[3]。促進(jìn)血管新生可改善CHD患者的心肌缺血、減緩癥狀發(fā)作并能改善預(yù)后，降低不良心血管事件的發(fā)生率[4-5]。因此，從傳統(tǒng)中藥中篩選發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)血管再生的關(guān)鍵藥效成分，對于CHD的防治具有重要價(jià)值。

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參具有增加冠脈流量[6]、降低心肌興奮性和傳導(dǎo)性、保護(hù)心肌缺血性損傷[7]、抗氧化[8-9]、保護(hù)心血管[10]、改善腎功能[11]、抗菌消炎[12]、抗腫瘤[13]等作用。丹參的主要化學(xué)成分為脂溶性的二萜醌類、水溶性酚酸類及其他類型化合物[14]。雖然目前已有較多丹參藥效成分的研究，但采用新模型、新技術(shù)探索丹參中是否存在其他潛在的抗CHD活性成分，依然具有重要價(jià)值。

斑馬魚是一種國際新興的新型脊椎模式動物，在血管生成途徑上與人類表現(xiàn)出高度的遺傳和功能的保守性，有87%的基因片段相同[15]。斑馬魚為整體動物，可以觀察到整體表型，與體外細(xì)胞模型相比，具有明顯優(yōu)勢。血管標(biāo)記熒光的轉(zhuǎn)基因系的斑馬魚不用染色即可觀察斑馬魚節(jié)間血管情況，使得測量血管再生結(jié)果更直觀精準(zhǔn)[16]。分子對接技術(shù)主要是研究受體與藥物分子之間的結(jié)合與相互作用，通過受體獨(dú)有特征，篩選可能結(jié)合的藥物分子以及結(jié)合模式和親和力，是當(dāng)下計(jì)算機(jī)模擬在藥物研究領(lǐng)域的重要輔助手段[17]。自20世紀(jì)70年代中期首次出現(xiàn)以來，分子對接已成為協(xié)助藥物設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特計(jì)算機(jī)模擬工具，如在大型化合物庫中識別新的化學(xué)支架[18]，為藥物重新定位、靶點(diǎn)確認(rèn)、預(yù)測不良反應(yīng)和其他方面進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[19]。中藥組成成分復(fù)雜，通過分子對接技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)活性成分的虛擬篩選，進(jìn)一步提高篩選的效率，降低篩選成本，已成為新藥發(fā)現(xiàn)的重要方法。因此，本研究應(yīng)用新型模式動物斑馬魚模型和分子對接技術(shù)深入研究丹參中促血管再生作用活性的關(guān)鍵成分，為候選藥物的發(fā)現(xiàn)、資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

1.1藥材

共收集2020—2021年不同產(chǎn)地的丹參藥材飲片，詳細(xì)信息見表1。所有樣品經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)韓利文副研究員鑒定為唇形科植物丹參S. miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，保藏于藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院中藥資源樣品庫中。

1.2藥品與試劑

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號K1723046）購自北京芯硅谷；酪氨酸激酶抑制劑PTK787（批號M1648-04）購自AbMole公司；亞甲基藍(lán)（批號619H022）購自北京索萊寶科技有限公司；鏈酶蛋白酶（批號41844523）購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3動物

血管標(biāo)記綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli1a：EGFP）來自國家斑馬魚資源中心。

1.4儀器

Z-A-S5型斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；IX83型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；ZSA0745型體式顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津）；DFY-1000型搖擺式多功能高速中藥粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；TDZ5型臺式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DZF型真空干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）。

2方法

2.1丹參提取物的制備

不同產(chǎn)地的丹參樣品按照相同方法進(jìn)行平行提取。丹參樣品用中藥粉碎機(jī)粉碎為粗粉，過3號篩；稱取15 g丹參樣品粉末放入500 mL圓底燒瓶中，加入90%乙醇120 mL（料液比1∶8），90 ℃水浴提取，提取2次，每次1.5 h；合并2次上清液，減壓濃縮，真空60 ℃干燥，即得丹參提取物。

隨機(jī)選取1個(gè)提取物樣本（DS01），準(zhǔn)確稱定，置10 mL量瓶中，加入80%甲醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。按照《中國藥典》2020年版一部丹參藥材含量測定項(xiàng)下規(guī)定，采用島津LC-20A型高效液相色譜儀，以乙腈-0.02%磷酸水溶液為流動相，測定DS12提取物中丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.46%，丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I之和為0.29%。

2.2丹參提取物的斑馬魚耐受實(shí)驗(yàn)

選擇發(fā)育至24 h（hours post fertilization，hpf）的斑馬魚受精卵，用脫膜劑鏈酶蛋白酶（1 mg/mL）進(jìn)行脫膜處理。隨機(jī)選取1個(gè)提取物樣本（DS01）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置不同質(zhì)量濃度的丹參提取物（100、200、400、600、800、1000、1500、2000 μg/mL）組和對照組（給予pH 7.1～7.4、溫度26.5～28.5 ℃、電導(dǎo)率490～530 μS、溶解氧質(zhì)量濃度5.0～7.5 mg/L的養(yǎng)魚水）。于體式鏡下觀察，記錄給藥24 h后斑馬魚畸形與死亡情況，計(jì)算死亡率。

采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計(jì)軟件通過回歸分析計(jì)算丹參提取物的最低致死質(zhì)量濃度，考察斑馬魚對丹參提取物的耐受性。

2.3丹參提取物對斑馬魚促進(jìn)血管生成活性的研究

將發(fā)育至24 hpf的斑馬魚受精卵用1 mg/mL的脫膜劑鏈酶蛋白酶進(jìn)行脫膜處理，將脫膜的斑馬魚放入24孔板，每孔10條。模型組中加入0.2 μg/mL PTK787，處理組先加入0.2 μg/mL PTK787后再加入丹參提取物或單體，對照組中加入空白溶劑（0.5% DMSO）。每孔加入養(yǎng)魚水保證每孔體積為2 mL。24 h后于熒光顯微鏡下觀察斑馬魚的節(jié)間血管情況并進(jìn)行拍照，用Image Pro 6軟件測量血管長度，統(tǒng)計(jì)節(jié)間血管總長度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4基于分子對接技術(shù)篩選丹參促血管生成的活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php）中以“丹參”為關(guān)鍵詞檢索丹參的化學(xué)成分，剔除沒有PubChem信息的化合物，將具有PubChem CID的化合物批量導(dǎo)入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中獲得化合物的sdf結(jié)構(gòu)，構(gòu)建丹參小分子庫，將獲得丹參小分子庫導(dǎo)入Schrodinger分子模擬包中，利用Ligpre模塊進(jìn)行2D sdf分子轉(zhuǎn)化為3D sdf格式，用于后期分子對接的準(zhǔn)備。

抑癌基因VHL介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）降解是調(diào)控下游血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的重要途徑。因此，在RCSB pdb數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中下載VHL-HIF-1α復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：3ZRC），將3ZRC導(dǎo)入Schrodinger的Maesrto10.1進(jìn)行蛋白前處理，由于3ZRC有多條同源鏈，選擇其中1條包含活性口袋的鏈進(jìn)行分子對接。蛋白經(jīng)過protein preparation模塊進(jìn)行補(bǔ)足缺失殘基以及中性化等操作，最后進(jìn)行能量最小化并添加OPLS2005力場。

分子對接的活性口袋由3ZRC自帶的配體進(jìn)行定義，直接選中3ZRC晶體中的配體生成對接盒子，對接盒子參數(shù)選擇軟件默認(rèn)。先進(jìn)性HTVS（high through virtual screening）模式的高通量篩選，將得到的化合物再次進(jìn)行SP（standard precision）模式的篩選，根據(jù)對接的結(jié)果篩選前10個(gè)結(jié)合能較高的化合物進(jìn)行可視化。為了驗(yàn)證對接的可靠性，本研究將3ZRC自帶配體抽出再對接到3ZRC中5次，計(jì)算對接結(jié)合模式的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值以評估對接的可靠性。對接的結(jié)果分別采用Pymol 2.4.1和Ligplus進(jìn)行可視化。

3結(jié)果

3.1丹參提取物在斑馬魚模型的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了更好地觀察藥物對于斑馬魚的致死效應(yīng)，將劑量的對數(shù)值與死亡率進(jìn)行回歸曲線擬合。GraphPad Prism 9軟件擬合的結(jié)果（圖1）顯示，丹參提取物質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，斑馬魚開始出現(xiàn)死亡；丹參提取物質(zhì)量濃度為1000 μg/mL時(shí)，斑馬魚全部死亡，但在600 μg/mL時(shí)就開始出現(xiàn)了斑馬魚發(fā)育異常（脊柱彎曲）的情況，表明丹參提取物已經(jīng)出現(xiàn)了致畸作用，因此本研究中丹參提取物的耐受劑量為400 μg/mL，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中質(zhì)量濃度最高設(shè)為400 μg/mL。

3.2丹參提取物促進(jìn)斑馬魚血管生成的劑量效應(yīng)

如圖2所示，PTK787處理斑馬魚后，斑馬魚節(jié)間血管生長不完整，沒有閉合，與對照組相比節(jié)間血管總長度顯著縮短（P＜0.01）且無畸形或死亡出現(xiàn)，表明血管損傷模型建立成功。隨機(jī)選取1個(gè)丹參提取物（DS01）考察樣品在斑馬魚模型上促進(jìn)血管生成作用的量效關(guān)系。發(fā)現(xiàn)丹參提取物質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，斑馬魚沒有明顯的血管生長出現(xiàn)；丹參提取物質(zhì)量濃度為100、150 μg/mL時(shí)，斑馬魚開始出現(xiàn)明顯的血管生長，與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.01）。說明丹參提取物能夠逆轉(zhuǎn)PTK787造成的斑馬魚血管損傷，且隨著丹參質(zhì)量濃度的增加，促血管再生作用有增強(qiáng)的趨勢。

3.3不同產(chǎn)地的丹參提取物對斑馬魚損傷血管生成的促進(jìn)作用

如圖3所示，不同產(chǎn)地的丹參提取物（150 μg/ml）均出現(xiàn)了不同程度的促血管生成作用，與模型組相比，均具有顯著性差異（P＜0.01）。不同產(chǎn)地的丹參提取物表現(xiàn)出了不完全一致的生物活性，其中DS06樣品促血管生成的活性最低，DS05樣品促血管生成的活性最高。

3.4分子對接技術(shù)分析

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中總共獲得143個(gè)具有PubChem信息的化合物，經(jīng)過Ligpre進(jìn)行處理轉(zhuǎn)化成3D結(jié)構(gòu)。在對接模型驗(yàn)證（Redocking）過程中，進(jìn)行了5次對接，最終3ZRC自帶的配體（PubChem ID：56684144）均對接到了活性口袋，且5次對接結(jié)合能均為−39.079 kJ/mol，RMSD值為0，對接具有非常高的可重復(fù)性，證明對接模型的可靠性。

在HTVS對接模式下由132個(gè)化合物成功對接到活性口袋，對接結(jié)合能−26.865～−2.807 kJ/mol。在SP對接模式下，總共有137個(gè)結(jié)合能小于0的化合物被成功對接，結(jié)合能為−31.091～−0.197 kJ/mol，有3個(gè)化合物的結(jié)合能大于0 kJ/mol，可能是VHL-HIF1a非抑制劑。表2為排名前10的化合物與3ZRC對接結(jié)合能及化合物信息，對接排名最高的化合物為丹酚酸B，結(jié)合能為−31.091 kJ/mol。對接結(jié)果顯示，3ZRC晶體自帶的共晶陽性配體（positive ligand，PL）剛好與3ZRC蛋白晶體的活性口袋契合（圖4-A），具有很好的重現(xiàn)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PL與活性口袋的TYR-98、HIS-110、SER-111和HIS-115 4個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵。圖4-B為丹酚酸B與3ZRC對接的模式圖，丹酚酸B主要通過PRO-99、TYR-98、ARG-107和HIS-110 4個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵并錨定在3ZRC的活性口袋，其中TYR-98和HIS-110 2個(gè)氨基酸殘基同樣出現(xiàn)了PL與3ZRC的對接模式中。

3.5丹酚酸B對斑馬魚損傷血管生成的促進(jìn)作用

如圖5所示，與模型組比較，10、20、40、80 μg/mL的丹酚酸B均具有顯著的促血管生成作用（P＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

4討論

斑馬魚體系現(xiàn)已被廣泛用于藥物篩選和毒理學(xué)研究[20-21]。斑馬魚胚胎和幼魚體積很小，可用微孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，故適合于高通量篩選[22]。斑馬魚屬于脊椎動物，是一種活體研究體系，可保留藥動學(xué)過程，故其與其他的體外研究體系相比更加適合用于中藥這種復(fù)雜化學(xué)體系的藥效學(xué)研究[23]。斑馬魚的受精卵或者魚苗能夠便利地從培養(yǎng)介質(zhì)中吸收親水或親脂的物質(zhì)，使得其檢測中藥的活性變得非常方便[24]。PTK787是一種酪氨酸激酶抑制劑，能夠特異性地抑制血管內(nèi)皮生長因子受體的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管生成[25]。研究表明，瓜蔞[26]、白芍[27]、天麻[28]、丹紅注射液[29]等在斑馬魚模型上均體現(xiàn)了明顯的促進(jìn)血管生成的作用，可逆轉(zhuǎn)PTK787誘導(dǎo)的血管損傷。

中藥的成分非常多，理化性質(zhì)復(fù)雜，在常規(guī)的細(xì)胞學(xué)篩選體系和分子篩選體系中采用中藥進(jìn)行新藥篩選時(shí)常常難以避免非特異性影響，從而產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。傳統(tǒng)中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)[30-31]，建立注重整體、精準(zhǔn)識別的藥效成分發(fā)現(xiàn)技術(shù)，一直是本領(lǐng)域的瓶頸環(huán)節(jié)。本研究借助計(jì)算化學(xué)的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，建立了基于斑馬魚模型的“虛擬篩選-活性評價(jià)”的藥效成分發(fā)現(xiàn)方法，使計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)結(jié)合，有效節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低實(shí)驗(yàn)成本，為天然藥效成分的高效發(fā)現(xiàn)提供新思路。研究表明，VHL蛋白中pVHL是HIF-1α家族的底物識別位點(diǎn)，靶向HIF-1α家族進(jìn)行泛素介導(dǎo)的蛋白酶體的降解[32-34]。在正常有氧條件下，HIF-1α通過脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）家族，在脯氨酸上被羥基化引發(fā)下游信號級聯(lián)。在低氧或缺氧條件下，當(dāng)PHD不能發(fā)揮功能或VHL突變時(shí)，則會改變pVHL與HIF-1α或elongin C的結(jié)合，HIF-1α不能被pVHL識別[35-37]。HIF-1α的聚集和轉(zhuǎn)錄會上調(diào)一些血管發(fā)育的重要基因（如促紅細(xì)胞生成素、VEGF），細(xì)胞增生的基因（血小板衍生因子-β、轉(zhuǎn)化生長因子-α）和糖代謝的基因（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1）[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參中丹酚酸B與VHL-HIF-1α復(fù)合物具有較高的對接性能，提示丹酚酸B促進(jìn)血管生成的作用可能與此作用有關(guān)，為后續(xù)的深入研究提供了方向。

綜上，本研究中成功建立了一個(gè)基于斑馬魚模型的“虛擬篩選-活性評價(jià)”的藥物篩選方法，并發(fā)現(xiàn)丹參中丹酚酸B是發(fā)揮促進(jìn)血管生成作用的關(guān)鍵成分，為丹酚酸B應(yīng)用于冠心病的防治以及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突