一、斑馬魚作為模式生物應(yīng)用的優(yōu)勢

斑馬魚作為模式生物的使用最早可追溯至20世紀(jì)60年代^［1］，最初被應(yīng)用于脊椎動(dòng)物發(fā)育的研究。自20世紀(jì)80年代以來，隨著斑馬魚全基因組測序的完成與基因編輯操作技術(shù)的發(fā)展^［2］，斑馬魚作為模式生物被廣泛應(yīng)用于研究基因功能、探討致病基因的作用機(jī)制、建立疾病模型用于治療藥物的篩選等。斑馬魚是重要的脊椎動(dòng)物模型，同時(shí)又具有無脊椎動(dòng)物的某些典型特征，填補(bǔ)了細(xì)胞培養(yǎng)和嚙齒動(dòng)物之間的空白。

 

（一）斑馬魚遺傳操作技術(shù)方法快捷

近年來，斑馬魚模式生物主要是通過反向遺傳學(xué)原理進(jìn)行造模。采用斑馬魚胚胎顯微注射技術(shù)向1~4細(xì)胞期的胚胎中注射嗎啉環(huán)修飾的嗎啉代反義寡核苷酸（morpholino，MO），干擾mRNA前體剪切或翻譯，可以短暫抑制特定基因的表達(dá)，一般維持3 d左右。這種反義寡核苷酸技術(shù)主要應(yīng)用于暫時(shí)性敲降在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中有表達(dá)的目的基因，快速簡便。而采用基因編輯技術(shù)則可產(chǎn)生穩(wěn)定突變體的斑馬魚，包括鋅指核酸酶（zinc finger nucleases）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases）技術(shù)以及CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9（CRISPR-associated protein 9）技術(shù)。通過基因工程改造的核酸酶可以精確靶向誘導(dǎo)雙鏈 DNA 斷裂（double strand break），誘導(dǎo)生物體通過非同源末端連接（non-homologous end joining）或同源重組（homology-directed repair）方式進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)敲除、插入、缺失或者堿基置換，以達(dá)到構(gòu)建永久性基因敲入/敲除斑馬魚模型的目的。向斑馬魚早期胚胎注射DNA或RNA可實(shí)現(xiàn)外源基因短期過表達(dá)，而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的插入品系，調(diào)控靶基因的持續(xù)表達(dá)，從而研究目的基因的生物學(xué)功能。

 

（二）斑馬魚肌肉表型分析可實(shí)現(xiàn)多元化和客觀量化

斑馬魚具有典型的運(yùn)動(dòng)行為，易于觀察和評價(jià)，肌肉發(fā)育迅速，在受精后17 h開始自發(fā)收縮。到了受精后24 h，肌節(jié)開始出現(xiàn)，胚胎能夠卷曲甚至對觸碰作出反應(yīng)。受精后48 h肌肉分化完全，幼魚在受精后96 h可自由游動(dòng)^［3］。利用胚胎自發(fā)卷繞和觸碰誘發(fā)的幼魚逃避反應(yīng)，可以簡單直接地評估斑馬魚肌病模型的運(yùn)動(dòng)功能^［4］。也可通過視頻記錄一定時(shí)間內(nèi)斑馬魚的游動(dòng)軌跡，分析其運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間，以比較運(yùn)動(dòng)能力的改變。

 

斑馬魚有較為完整的評價(jià)體系來評估其肌肉結(jié)構(gòu)。骨骼肌在斑馬魚軀干中占相當(dāng)大的比例，其肌節(jié)的超微結(jié)構(gòu)和收縮特性均與人類肌肉有著極高的相似性^［5］。斑馬魚骨骼肌高度有序的肌節(jié)形狀在偏振光下顯得明亮，其雙折射特性使肌肉結(jié)構(gòu)損傷的定量評估成為可能。研究人員可以通過雙折射分析在活體或固定標(biāo)本上快速、無創(chuàng)地評估肌肉結(jié)構(gòu)的破壞情況^［6］。斑馬魚的胚胎透明特性有利于肌肉發(fā)育的監(jiān)測，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將外源熒光蛋白基因單獨(dú)或作為融合蛋白的一部分導(dǎo)入斑馬魚胚胎，目前已有較為成熟的標(biāo)記斑馬魚肌肉結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系如Tg2（smyhc1：EGFP）^［7］。也可利用免疫組織化學(xué)、免疫熒光技術(shù)進(jìn)行斑馬魚肌病模型中肌纖維和肌節(jié)結(jié)構(gòu)缺陷的觀察。

二、斑馬魚作為模式生物在遺傳性肌肉疾病研究中的應(yīng)用

遺傳性肌病新的致病基因及眾多意義未明的變異位點(diǎn)的致病性都亟需動(dòng)物模型驗(yàn)證，同時(shí)，此類疾病治療手段的匱乏也要求強(qiáng)大的篩選平臺(tái)以支持干預(yù)措施的研究。鑒于以上斑馬魚作為模式生物的顯著優(yōu)勢，如能推動(dòng)斑馬魚在遺傳性肌肉疾病領(lǐng)域的應(yīng)用，可以更好地應(yīng)對基因檢測技術(shù)普及帶來的機(jī)遇與挑戰(zhàn)，促進(jìn)遺傳性肌肉疾病致病機(jī)制的研究及潛在藥物的發(fā)現(xiàn)。下面簡述斑馬魚作為肌肉疾病模式生物代表性的研究應(yīng)用，以啟發(fā)科研工作者開拓視野，促進(jìn)研究領(lǐng)域?qū)W術(shù)發(fā)展。

 

（一）遺傳性肌肉疾病致病基因的驗(yàn)證

遺傳性肌肉疾病多具有顯著的遺傳異質(zhì)性，尤其是肌營養(yǎng)不良、先天性肌病等^［8］，這些疾病的癥狀往往相互重疊，僅通過臨床表型無法準(zhǔn)確判斷疾病的亞型，因此需要借助分子遺傳學(xué)手段進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，并以此為基礎(chǔ)開展遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。另外，隨著基因檢測成本的降低，研究者發(fā)現(xiàn)了大量臨床意義未明的變異，持續(xù)不斷地?cái)U(kuò)大著肌病相關(guān)的基因突變譜系。然而，未報(bào)道過的新基因或變異位點(diǎn)需慎重判斷其致病性，有效的動(dòng)物模型往往能提供可靠的證據(jù)。

 

斑馬魚骨骼肌生長和發(fā)育過程高度保守，80%以上與人類肌肉疾病有關(guān)的基因都可以在斑馬魚基因組中找到同源基因，包括編碼抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合物、興奮-收縮耦聯(lián)組分等基因^{［9, 10, 11］}，這意味著斑馬魚非常適合作為構(gòu)建遺傳性肌肉疾病的模型。另一方面，相較于國內(nèi)常用的小鼠模型，斑馬魚體外受精易于對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)操作，降低了建模難度。另外，一對健康成年斑馬魚一次交配可產(chǎn)卵200枚以上，產(chǎn)卵間隔僅1周，且發(fā)育迅速，極大地縮短了模型構(gòu)建周期。

 

（二）遺傳性肌肉疾病致病機(jī)制的研究

相對于細(xì)胞和組織層面，利用斑馬魚來研究疾病的分子機(jī)制是在體內(nèi)模型的層面，更容易得出讓人信服的結(jié)論，可在一定程度上替代體外模型。借助整胚原位雜交技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等，能在胚胎組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)不被破壞的條件下，從整體上把握肌病背景下相關(guān)分子mRNA及蛋白水平的改變。熒光探針技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在斑馬魚活體水平標(biāo)記疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并可在病理狀態(tài)下觀察其動(dòng)態(tài)改變。

 

此外，斑馬魚信號(hào)傳導(dǎo)通路與人類近似，氧化應(yīng)激水平增加與RyR1相關(guān)肌病、自噬功能受損與肌原纖維肌病等都得到了斑馬魚模型證據(jù)的支持。ryr突變幼魚細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的部分通路發(fā)生了顯著改變，特別是氧化應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)的增加^［12］。Bag3缺乏的斑馬魚肌肉電鏡下可觀察到自噬囊泡結(jié)構(gòu)異常，誘導(dǎo)自噬流后免疫印跡顯示自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ積聚減少，表明其自噬活性受損^［13］。

 

（三）遺傳性肌肉疾病治療靶點(diǎn)的篩選

結(jié)合高通量測序及肌肉病理分析，遺傳性肌病大多數(shù)已經(jīng)可以得到精準(zhǔn)診斷，但絕大部分遺傳性肌病仍然缺乏有效的干預(yù)手段，相當(dāng)一部分患者并未因精準(zhǔn)診斷而獲益，因此遺傳性肌病未來研究的重點(diǎn)應(yīng)該放在新型藥物研發(fā)和基因治療等領(lǐng)域。斑馬魚模型既可以像體外實(shí)驗(yàn)?zāi)菢訉ψ饔冒悬c(diǎn)明確的候選化合物進(jìn)行靶向篩選，也可以像哺乳動(dòng)物一樣對靶點(diǎn)不明或致病機(jī)制不明的疾病進(jìn)行基于藥效學(xué)的干預(yù)藥物篩選和評價(jià)，能夠提高藥物早期藥效學(xué)評價(jià)的靈敏性和可靠性，還可以進(jìn)行基因編輯治療的探索。如果能將斑馬魚模型和哺乳動(dòng)物模型相結(jié)合，可以從整體上縮短干預(yù)藥物或措施的研發(fā)實(shí)驗(yàn)周期，降低成本和風(fēng)險(xiǎn)，提高研發(fā)效率。

 

與嚙齒類動(dòng)物相比，斑馬魚易飼養(yǎng)、體積小，其胚胎可以在96孔或384孔板中培養(yǎng)。而且在培養(yǎng)皿中的斑馬魚胚胎可以直接吸收添加至培養(yǎng)液中的藥物，適合進(jìn)行中到高通量的藥物篩選的初步研究。基于斑馬魚的迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）模型已篩選了超過4 500種小分子化合物^［14］，發(fā)現(xiàn)了至少25種有效藥物，如非選擇性磷酸二酯酶抑制劑氨茶堿^［15］、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑氟西汀^［16］、靶向血紅素加氧酶信號(hào)通路的西地那非^［17］等。除上述靶向參與DMD發(fā)病機(jī)制相關(guān)途徑來改善肌肉功能和質(zhì)量，斑馬魚模型也適用于評價(jià)基因組編輯療法、基因產(chǎn)物修飾如外顯子跳躍和終止密碼子通讀等基因治療策略。有研究者向dystrophin基因無義突變的斑馬魚胚胎中注射影響轉(zhuǎn)錄物剪接的MO，將攜帶突變的外顯子從成熟的mRNA中去除，恢復(fù)了部分dystrophin蛋白的功能，斑馬魚肌節(jié)結(jié)構(gòu)顯著改善，從而證實(shí)了外顯子跳躍治療策略的可行性^［18］。

三、斑馬魚模型應(yīng)用的局限性

首先，斑馬魚組織解剖結(jié)構(gòu)與人類的相似性不如小鼠，如哺乳動(dòng)物快肌與慢肌相間分布，而斑馬魚快肌與慢肌在位置上完全分離。其次，針對斑馬魚的抗體種類較少，定制斑馬魚抗體耗時(shí)且成本較高，一定程度上限制了分子機(jī)制的研究。此外，浸泡給藥方式無法準(zhǔn)確控制藥物攝取量，斑馬魚的藥物代謝系統(tǒng)與人類有一定差異，給藥物臨床轉(zhuǎn)化帶來困難。另外，斑馬魚肌肉疾病模型的質(zhì)量控制尤為重要，不能僅以斑馬魚形態(tài)和運(yùn)動(dòng)功能等非特異性改變?yōu)樵u價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，必須有如桿狀體、中央核或軸空等病理組織化學(xué)特征以及dystrophin蛋白的表達(dá)缺失等分子病理特征支持^{［19, 20］}，以產(chǎn)生符合人類疾病特征又可擴(kuò)展用于高通量藥物篩選的可靠疾病模型。

四、展望

由于斑馬魚模型在遺傳和胚胎操作以及肌肉結(jié)構(gòu)和功能評價(jià)方面的優(yōu)勢，近年來備受研究人員青睞，在國際上已被廣泛應(yīng)用于肌肉疾病發(fā)病機(jī)制的研究和治療開發(fā)，且已取得了一系列令人振奮的研究成果。展望未來，生命與健康領(lǐng)域中最富創(chuàng)造力的將是新藥研發(fā)，斑馬魚模型憑借體外細(xì)胞培養(yǎng)和其他模式動(dòng)物不可替代的獨(dú)特優(yōu)勢，將成為大規(guī)?；瘜W(xué)藥物篩選和探索基因治療的強(qiáng)大工具，也必將為人類逐漸征服遺傳性肌肉疾病發(fā)揮重要作用。