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淺談基因組編輯技術(shù)


基因組編輯(GenomeEditing)技術(shù)指的是通過(guò)使用工程核酸內(nèi)切酶或稱“分子剪刀”在有機(jī)體的基因組中實(shí)現(xiàn)DNA片段的插入、刪除或者替換,是新近發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)革命性的遺傳工程方法。2008年,基因組編輯技術(shù)獲得了關(guān)鍵性突破,使用鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)技術(shù)(第一代基因組編輯技術(shù))首先獲得了對(duì)基因組定向破壞的斑馬魚(yú)突變新品系。隨后這一技術(shù)獲得了爆發(fā)性的進(jìn)步。2012年轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)技術(shù)(第二代基因組編輯技術(shù))由于其設(shè)計(jì)和構(gòu)建比ZFN技術(shù)簡(jiǎn)便,成功率高,可廣泛地應(yīng)用于任何動(dòng)植物基因組的修改(靶向刪除或定點(diǎn)插入)等特點(diǎn),被科學(xué)(Sci- ence)雜志選列為2012年全球十大科技進(jìn)展之一。       2013年1月,更為簡(jiǎn)單的CRISPR/Cas9(成族重復(fù)間隔短回文序列)系統(tǒng)被用于基因組編輯。作為第三代基因組編輯技術(shù),CRISPR/Cas9技術(shù)簡(jiǎn)單、高效、且沒(méi)有物種限制,因而迅速風(fēng)靡全球,被Science列為2013年十大科技進(jìn)展之一,2015年再被Science列為十大科技進(jìn)展之首?,F(xiàn)在,CRISPR/Cas技術(shù)已廣泛應(yīng)用于人、大小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、豬、羊、水稻、小麥和擬南芥等動(dòng)植物(細(xì)胞)、酵母和蘑菇等真菌以及細(xì)菌等微生物的基因組靶向改造,成為后基因組時(shí)代的功能基因組研究、動(dòng)植物品種改良、疾病模型建立以及基因治療等不同領(lǐng)域開(kāi)展基礎(chǔ)研究與應(yīng)用研究的遺傳工程利器       CRISPR/Cas9基因組編輯工具系統(tǒng)涉及到sgRNA和Cas9兩種成分。在細(xì)胞內(nèi),Cas9蛋白在單一的向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)下識(shí)別并切割基因組上的目標(biāo)靶位點(diǎn),從而在基因組上人為定向制造出雙鏈斷裂(DSB)。DSB一旦形成,會(huì)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性的DNA損傷修復(fù)機(jī)制以修復(fù)DSB。       細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)包括非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)、微同源介導(dǎo)的末端連接修復(fù)(MMEJ)和同源重組修復(fù)(HR)等三種主要形式。前兩種修復(fù)均為易錯(cuò)修復(fù),修復(fù)的結(jié)果是在DSB附近形成插入/缺失突變。如果插入/缺失突變是個(gè)移碼突變且發(fā)生在關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的外顯子上,則可能使目標(biāo)基因因移碼而不能編碼出有活性的蛋白,從而成為一種無(wú)效等位基因,結(jié)果導(dǎo)致基因敲除;如果同時(shí)向細(xì)胞內(nèi)提供同源供體,這些供體會(huì)有機(jī)會(huì)被當(dāng)作用于DSB修復(fù)的同源供體,結(jié)果細(xì)胞通過(guò)HR修復(fù),成功實(shí)現(xiàn)在指定位置的基因敲入。

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